اصول تکنیک الکتروفورز DGGE (ژل الکتروفورز با گرادیان شیب ماده دناتوره کننده)

امتیاز کاربران

ستاره فعالستاره فعالستاره فعالستاره فعالستاره فعال
 

مطالب مرتبط: 

 

اصول تکنیک الکتروفورز DGGE

ژل الکتروفورز با گرادیان شیب ماده دناتوره کننده , اصول تکنیک الکتروفورز DGGE , پروتکل تهیه ژل تکنیک DGGE , انتخاب شیب دناتورانت , تهیه محلول آکریل آمید , کستینگ گرادیان ,  لایه بوتانول , ژل استکینگ و شانه

 

جداسازی مولکول­های DNA در تحقیقات ژنومی دارای اهمیت زیادی می­باشد. تکنیک الکتروفورز بر اساس اعمال ولتاژ و جریان مناسب موجب جداسازی این مولکول­ها می­گردد. در واقع مولکول­های DNA نوعی پلی آنیون می­باشند که به راحتی در میدان الکتریکی حرکت می­کنند. وجود ژل­های با منافذ مختلف موجب جداسازی این ماکرومولکول­ها بر اساس سایز می­گردد. اما، در بسیاری از مواقع اندازه مولکول­ها کاملا یکسان می­باشد و تنها تفاوت در ترکیب بازهای قطعات DNA می­باشد. به عنوان مثال در قطعات جهش یافته و پلی­مورفیسم­ها این تغییرات به خوبی قابل مشاهده می­باشد. جهش­های در حد جابجایی تک جفت باز بر خلاف اندازه بسیار کوچک تغییر، ممکن است بتواند تغییرات فوق­العاده بزرگی را بوجود آورد. به عنوان مثال در کمخونی داسی شکل تنها با تغییر یک باز مشکلات مورفولوژیک کشنده ایجاد می­گردد. بررسی این تغییرات جابجایی در حد تک باز با استفاده از سیستم الکتروفورزی افقی که قادر است تفاوت­های در اندازه قطعات مختلف DNA را بر اساس میزان حرکت بر روی ژل آگارز نشان دهد، امکان­پذیر نمی­باشد. بنابراین لازم است با استفاده از تکنیکی دیگر برای انجام این موضوع استفاده کرد. دستگاه ژل الکتروفورز شیب غلظتی دناتورانت (DGGE) قادر است بر اساس اختلاف در حد تک جفت باز به جداسازی مولکول­های DNA بپردازد. اساس کار این تکنیک، مد نظر قرار دادن تفاوت در میزان پایداری جفت بازهای GC (دارای سه پیوند هیدروژنی) با AT (حاوی دو پیوند هیدروژنی) می­باشد. در واقع با تغییر در قطعات DNA و تبدیل بازهای aT به GC موجب تغییر در پایداری مولکول خواهد شد که همین اختلاف عاملی برای  شناسایی قطعات مختلف می­باشد. به منظور بررسی این جهش­ها از تفاوت در نقطه ذوب استفاده می­شود. برای این هدف، یک شیب افزاینده از مولکول­های دناتوره کننده اوره و فرمامید که به صورت خطی در ژل اکریل آمید افزایش می­یابند استفاده می­شود. این افزایش در غلظت دناتورانت به همراه دمای اعمال شده به محیط (بین 50-70) موجب ذوب شدن نواحی مختلف DNA به صورت جدا گانه می­گردد. در ناحیه خاصی از غلظت دناتورانت مولکول جهش یافته با نوع وحشی خود دارای تفاوت خواهد بود که یکی به صورت جزیی ذوب شده ودیگر ذوب نشده است. مولکول­هایی که به صورت جزیی ذوب می­شوند قابلیت عبور از میان منافذ ژل را کمتر دارا می­باشند و با سرعت کمتری بر روی ژل حرکت می­کنند. همین امر موجب جدایی و متعاقبا شناسایی آنها می­گردد.

 DGGE دستگاهی است که جهت انجام تکنیک مذکور مورد استفاده قرار می­گیرد.

 

پروتکل تهیه ژل تکنیک DGGE

در واقع کیفیت نتایج DGGE بسیار وابسته به محصولات PCR مورد استفاده در آن می باشند.

 

کلیات آزمایش

تکنیک DGGE یک روش جداسازی الکتروفورزی می­باشد که بر اساس تفاوت های در رفتار ذوب شدن قطعات دو رشته ای DNA صورت می­گیرد.

دستگاه DGGE ساخت دنا ژن تجهیز قابلیت ران نمودن یک ژل پلی اکریل امید را جهت بررسی تغییرات تک باز، پلی مورفیسم ها و جهش ها در قطعات DNA کلون شده و یا تکثیر یافته دارا می باشند. دستگاه قادر است تا دمای 65 درجه سانتیگراد تنظیم شود از این رو دامنه کامل تکنیک DGGE می تواند اینجا صورت بگیرد.  در اینجا عمل الکتروفورز در یک ژل عمودی اکریل آمید در یک شیب غلظتی از دناتورانت ها صورت می­گیرد. در این تکنیک مهم است که بافر در محفظه بالایی به خوبی سیرکوله شود تا از اتلاف اجزای آن جلوگیری گردد. بعلاوه ، ژل باید در دمای ثابت و هموژن باشد (در اینجا مثلا 60 درجه سانتیگراد). برای تکمیل این عمل، ژل در یک اکواریوم شامل بافر قرار داده می­شود. بافر با استفاده از پمپ ترموستات بین محفظه بالایی بافر و تانک سیرکوله می­گردد. به منظور تسهیل جریان محلول مازاد از بخش بالایی دو سوراخ در قسمت بالایی تعبیه گردیده است. در بعضی سیستم ها، همزدن بافر  و نیز ایجاد یکنواخت دمایی با استفاده از یک مگنت که توسط همزن قرار گرفته در زیر آن است، صورت میگیرد.

 

ژل ریزی

انتخاب شیب دناتورانت

به منظور set up نمودن یک عمل DGGE جدید، معمولا از طیف وسیعی از شیب های غلظتی استفاده می­شود (20-28 ٪ از دناتورانت). اگرچه، به زودی در ناحیه مورد نظر که باید شامل بیشترین و نیز کمترین باندها در نمونه های مختلف باشد ، متمرکز می­شویم. شیب غلظتی باکتریایی مانند شیب غلظتی یوکاریوت ها بین 30-55 ٪ می باشد.  ژل با ضخامت 1.5 میلیمتر می باشد و شامل 8 ٪ پلی اکریل آمید می باشد.

تهیه ژل

  • پلیت ها را با استفاده از دترجنت و نیز اتانول 97 ٪ تمیز نمایید.
  • دو طرف اسپیسرها را گریس کاری نمایید (در طول کامل اسپیسر اما یک چهارم پهنای آن).
  • آنها را به صورت کلمپ ساندویچی در استند مربوط به کستینگ قرار دهید.
  • با استفاده از آب دیونیزه LEACKING سیستم را چک نمایید.

هنگامی که گریس سیلیکون بر روی اسپیسرها استفاده نمی شود، باندهای DGGE به صورت باندهای با انحنای رو به پایین دیده می شوند (بر خلاف حالت SMILING).استفاده از گریس به مقدار زیاد موجب از بین بردن کیفیت ژل می کند.

تهیه محلول آکریل آمید

مواد شیمیایی: 0 و 100 درصد اکریل آمید، APS و TEMED

  • محلول های 0 و 100 ٪ اکریل آمید را به گونه ای مخلوط نمایید که 23 میلی لیتر از محلول اکریل آمید با بیشترین غلظت دناتورانت (مثلا 55 ٪) و 23 میلی لیتر از محلول اکریل آمید با کمترین غلظت دناتورانت (مثلا 30 ٪) تهیه گردد.
  • 100 میکرولیتر APS و 8 میکرولیتر TEMED را به محلول های اکریل آمید با غلظت کم و زیاد افزوده و فورا مخلوط نمایید.

کستینگ گرادیان (در اینجا سریع عمل نمایید)

  • در ابتدا مطمئن باشید که پمپ خاموش است و کانال گرادیان میکر نیز بسته است.
  • محلول حاوی اکریل آمید با غلظت با لا را در محفظه راست گرادیان میکر (که به سمت پمپ است) و اکریل آمید کم را در محفظه چپ بریزید.
  • با همزن محفظه سمت راست هم زده شود.
  • همزمان پمپ را روشن نمایید تا با سرعت 5 میلی لیتر در دقیقه محلول را پمپ نماید.
  • سریع چک نمایید که آیا محلول های با غلظت کم و زیاد اکریل آمید با هم مخلوط می شوند (اغلب اوقات حباب هوا کانال را بلاک می نماید؛ در این هنگام به آرامی گرایدان میکر را کج نمایید تا مانع برطرف گردد.)
  • محفظه ژل به آرامی پر میگردد.
  • هنگامی که اکریل آمید تقریبا به فاصله 0.5 سانتیمتری زیر کامب رسید، ورود محلول را متوقف نمایید (کامب بعدا قرار میگیرد).
  • سیستم تیوبینگ را خالی نمایید و با استفاده از اب مقطر با شدت زیاد تمیز نمایید.

لایه بوتانول

  • فورا بعد از ریختن ژل، مقدار کمی از محلول بوتانول اشباع از آب را بر روی سطح ژل ریخته تا یک سطح صاف بدست آید.
  • حداقل 30 دقیقه به ژل اجازه داده تا پلیمریزه گردد.
  • بعد از پلیمریزه شدن ژل، روی سطح آن سه باز آب مقطر ریخته تا بوتانول کامل خارج گردد.
  • با دقت فاصله بین پلیت ها را با استفاده از کاغذ واتمن خشک نمایید.

ژل استکینگ و شانه

  • کامب را در محل خود در ساندویچ کستینگ قرار داده و با استفاده از محلول تهیه شده با 5 میلی لیتر اکریل آمید 0 ٪، 5 میکرولیتر TEMED، و 50 میکرولیتر APS بوسیله پیپت پاستور محفظه بالایی را پر نمایید.
  • به مدت حداقل 15 دقیقه به ژل استکینگ اجازه دهید تا پلیمریزه گردد.

نکته

در صورتی که دمای آزمایشگاه بالاتر از 27 درجه سانتیگراد باشد می­توان میزان APS و TEMED را کاهش داد؛ زیرا دمای بالا سرعت پلیمریزاسیون را کاهش می دهد.

 

ران نمودن ژل

در اینجا در ولتاژ 60 ولت به مدت 15.5 ساعت ژل ران گردیده است.

فرایند قبل از ران نمودن

  • تانک را به همراه هسته رانینگ ژل در اکواریوم پر شده با 23 لیتر محلول TAE5 X قرار دهید. پس از 4 بار ران نمودن ژل، بافر را تعویض نمایید.
  • سطح بافر موجود در آکواریوم را چک نمایید، در صورت نیاز آن را با DEMI پر نمایید. سیرکولاسیون را شروع نمایید (دمای 60 درجه سانتیگراد) تا محلول گرم گردد (این کار حدود 20 دقیقه طول میکشد).

قبل از بارگیری نمونه­ ها

کامب را خارج نمایید و با استفاده از سرنگ به چاهک ها بافر تزریق نمایید.

کل چاهک ها را با بافر پر نمایید.

بارگیری نمونه ها

  • نمونه های مخلوط شده با LOADING BUFFER را با استفاده از نمونه بردار به چاهک های تعبیه شده در ژل اضافه نمایید.
  • به منظور تعیین دقیق مکان باندها سه ردیف مارکر در سمت چپ ، راست و وسط اضافه نمایید.
  • محفظه ژل را در اکواریوم و محفظه خنک کننده قرار دهید.

شروع ران نمودن

  • فرایند رانینگ را شروع نمایید ؛ سیرکولاسیون را نیز چک کنید. جریان موجود در محفظه بالایی باید کم و آرام باشد. اطمینان حاصل شود که محفظه بالایی پر شده است. جریان در تانک می­تواند خیلی شدیدتر باشد. در حالی که الکترودهای مثبت و منفی را چک می­نمایید درب تانک را ببندید. چک شود که بافر از دو طرف تانک به داخل اکواریوم سر ریز می­کند.
  • پاور را در 60 ولت استارت نماییدو آمپر آن نیز روی 20 میلی آمپر باشد.
  • دور آکواریوم را با ستفاده از پوشش پلاستیکی بپوشانید تا تبخیر صورت نگیرد.
  • به مدت 15.5 ساعت سیستم را ران نمایید.

خاتمه ران

  • پمپ و پاور را خاموش نمایید.
  • ژل را از محفظه ژل خارج نمایید.
  • ژل موجود در روی پلیت را در 1 x TBE/EthidiumBromide به مدت 60 دقیقه، به همراه shaking آرام انکوبه نمایید. اطمینان حاصل شود که ژل در هنگام shaking به پلیت نچسبیده است.
  • ژل را با لیز دادن آرام و با دقت بر روی ترانس ایلومیناتور قرار دهید.
  • تصویر مورد نظرتان را تهیه نمایید.

 

فیلم آموزش انجام تکنیک الکتروفورز DGGE (زبان انگلیسی)

 

♦♦♦ در صورت داشتن هرگونه سوال در مورد این موضوع برای ما نظر بگذارید (در پایین همین صفحه). در اسرع وقت به تمامی سوالات شما توسط کارشناس مربوطه پاسخ داده خواهد شد. با تشکر ♦♦♦

مطالب مشابه :

کانال تلگرامی بیوتکنولوژی و زیست شناسی اینستاگرام بیوتکنولوژی, bio1 ریسرچ گیت گوگل اسکولار بیوتکنولوژی لینکدین بیوتکنولوژی
تمام حقوق این سایت متعلق به گروه bio1 به سرپرستی پوریا غلامی تیلکو می باشد . نقل مطالب متمم بدون ذکر منبع، تخلف محسوب شده و متخلفین بر اساس قوانین جاری کشور مورد پیگرد قانونی قرار می گیرند.

جستجو