اصول PCR و کاربردهای آن، طراحی پرایمر

امتیاز کاربران

ستاره فعالستاره فعالستاره فعالستاره فعالستاره فعال
 

اصول PCR و کاربردهای آن، طراحی پرایمر

اصول PCR , کاربردهای آن , طراحی پرایمر , مواد و وسایل لازم برای PCR ,  DNA الگو , (Template   DNA) ,  دزوكسي نوكلئوتيد تري فسفات , (dNTPs) , پرایمرهای Forward و Reverse , طراحی پرایمر , Taq DNA   polymerase , بافر , ترموسایکلر مراحل  PCR , مرحله واسرشت ,  (Denaturation step) , مرحله اتصال ,  (Annealing step) , مرحله پليمريزاسيون یا طویل شدن , Extension/elongation step , ادامه PCR بعد از چرخه اول , مرحله طویل شدن نهایی , (Final elongation) , نگهداری نهایی , (Final hold) , ردیابی , (detect) , محصول PCR , کاربردهای PCR , انگشت نگاری ژنتیک , (genetic fingerprinting) , بررسی DNA قدیمی ,  (ancient DNA) , جداسازی DNAی ژنومی , تعیین توالی DNA , کلونینگ با PCR , انواع PCR , BAX Dupont-Qualicon , Allele-specific PCR Asymmetric PCR , Assembly PCR یا , (Polymerase Cycling Assembly: PCA) , Hot-start PCR Intersequence-specific PCR ,  Inverse PCR , Miniprimer PCR RT-PCR , ترانس کریپتاز معکوس ,  (reverse transcriptase) , واکنش زنجيره ی پليمراز , نسخه برداری معکوس RT-PCR , مشکلات PCR , باید ها و نباید ها در PCR , واکنش زنجیرهٔ پلیمراز , Polymerase Chain Reaction , که مخفف آن , PCR , واکنش زنجیره ای پلیمراز (PCR) , تکنیکی در , زیست شناسی مولکولی , به منظور , تکثیر یک نسخه منفرد , یا نسخه های کمی از یک , قطعه DNA , توالی خاص , تکنیک ,قطعه خاص از DNA , تشخیص و نظارت , بر بیماری های ژنتیکی، ,  شناسایی مجرمان , زمینه پزشکی قانونی ,  مطالعه عملکرد

مقدمه


در گذشته براي توليد قطعات نوكلئوتيدي معمولا از روش هاي شيميايي استفاده مي‌كردند و یا برای بدست آوردن نسخه های متعدد از يک ژن خاص، اين ژن را به داخل حامل مناسب وارد کرده و در يک باکتری تکثير می نمودند. اين روش ها پر زحمت بوده و نياز به مدت زمان طولاني داشتند. تکنیک PCR (واکنش زنجیره ای پلیمراز Polymerase Chain Reaction ) به منظور تکثیر یک قطعه DNA در سال ۱۹۸۴ توسط کری مولیس (Kary Mullis) کارمند شرکت Cetus ارائه شده است. PCR  مزاياي بسیاری داشت (از جمله بررسي يك روزه نمونه ها، ارزان بودن نسبي، آساني انجام و فوق العاده اختصاصي بودن) و انقلابي در تشخيص كلينيكي بيماري ها، پزشكي، علوم جنايي و پليسي، ميكروبيولوژي و بسياري صنايع ايجاد كرد. اين تکنيک تمامی مشکلات قبلی در زيست مولکولی که ناشی از عدم دسترسی به مقادير زياد از DNA يکسان بود را برطرف کرد و امروزه تقريباً در تمامی آزمايشگاههای زيست مولکولی جزو کارهای متداول بوده و به صورت اتوماتيک بوسيله ی کامپيوتر انجام می شود. به دلیل همین كشف در سال ۱۹۹۳، جایزه نوبل به کری مولیس اهداء گردید.

PCR همانند یک دستگاه فتوکپی عمل می کند که بوسیله آن می توان صفحاتی از کتاب ژنوم هر موجود را به تعداد دلخواه و مشابه نسخه اصلی (البته در مواردی همراه با خطاهای جزئی) تکثیر نمود. با اين روش مي توان يك ژن را به اندازه اي تكثير كرد تا بتوان با استفاده از روش‌هايي مانند الكتروفورز مشاهده كرد. شما يك تار مو را از فاصله 6 متري نمي توانيد ببينيد اما يك دسته ميلياردي از مو كنار هم به خوبي مشاهده مي شوند.

اساس این روش بسیار ساده بوده و مانند واکنش همانندسازی DNA در موجودات زنده توسط آنزیم DNA  پلیمراز صورت می گیرد. در موجودات زنده، مجموعه ای از چند پروتئین و آنزیم در فرآیند همانند سازی DNA نقش دارند در حالی که در واکنش PCR تنها نوع خاصی آنزیم DNA پلیمراز مقاوم به حرارت به نام Taq polymerase  به همراه بافر، کلرید منیزیم و نوکلئوتیدها استفاده می شود. در این تکنیک ابتدا پرايمراز DNA  موردنظر، طراحي مي شود و بعدا با استفاده ازPCR ، هدف را تكثير كرده و توسط الكتروفورز در مقابل يك كنترل مي سنجند.

مواد و وسایل لازم برای   PCR

1- DNA الگو (Template   DNA)

PCR تكنيكي است كه به واسطه آن مي توان از يك رشته DNA الگو، تعداد زيادي رشته DNA به دست آورد به شرطي كه دو انتهاي رشته ی  DNAكه قصد تكثيرش را داريم كاملا شناخته شده باشد. قطعه ی DNA می تواند محصول استخراج DNA ژنومی،DNA  پلاسمیدی یا حتی محصول  PCRدیگری باشد. چنانچه DNA هدف بصورت مالتی کپی در ژنوم باشد بهتر است. معمولاً حدود یک نانوگرم از DNA  پلاسمیدی یا فاژی یا یک میکروگرم از DNA ژنومی برای یک واکنش PCR کافی است. بیش از این مقدار، باعث تولید محصولات غیر اختصاصی (قطعات DNA دیگری غیر از قطعه مورد نظر) شده و مقدار کم نمونه DNA نیز باعث کاهش دقت واکنش PCR یا عدم تکثیر قطعه مورد نظر می گردد. کیفیت نمونه DNA نیز مهم است به طوری که باقی ماندن ترکیبات مورد استفاده در مرحله استخراج DNA مثل فنل وEDTA، باعث کاهش فعالیت آنزیم Taq polymerase و عدم حصول نتیجه مورد نظر می گردد. همچنین آلوده شدن واکنش PCR با مقادیر بسیار اندک DNA از هر منبع دیگری، به دلیل حساسیت فوق العاده این تکنیک، ممکن است به تولید قطعات غیر قابل انتظار بیانجامد. در مواد غذایی روند زیر برای تهیه DNA  وجود دارد.

2- دزوكسي نوكلئوتيد تري فسفات (dNTPs)

چهار نوکلئوتید تشکیل دهنده قطعهDNA ، بلوک های ساختمانی هستند که توسط DNA پلیمراز برای ساختن رشته های DNAی جدید بکار میروند و باید كنار هم چيده شوند تا رشته مكمل را ايجاد كنند. غلظت مورد نیاز از هر یک از نوکلئوتیدها برای واکنش PCR یکسان و برابر 200 نانو مولار می باشد. برای این منظور از مخلوط های آماده، واجد هر چهار نوکلئوتید که با غلظت های مختلف مثل دو میلی مولار، 10 میلی مولار و 25 میلی مولار موجود است، استفاده می شود. به طور مثال، در یک واکنش 50 میکرو لیتریPCR  باید 5 میکرولیتر از مخلوط دو میلی مولار نوکلئوتیدها برای دستیابی به مقدار مورد نیاز در واکنش استفاده کرد.

3- پرایمرهای Forward و Reverse 

پرایمرها قطعات کوچک پلی نوکلئوتیدی هستند و در آزمایشگاه به گونه ای طراحی و سنتز شده اند که دارای سکانس نوکلئوتیدی مکمل با ناحیه َ۳ در یکی از رشته های DNAی مورد نظر هستند. چون آنزیم DNA پلیمراز به قطعات پرایمر متصل می شود، در نتیجه فقط مولکول DNAی هدف، همانند سازی و تکثیر می گردد. از آنجائيکه DNA دو رشته ای است، دو نوع پرايمر در PCR مورد نياز است. پرايمرها دو عمل انجام مي دهند؛ اول اين كه محل ژني را كه بايد تكثير شود مشخص مي‌كنند و دوم اين كه اندازه قطعات تكثير شونده را تعيين مي كنند. صحت نتایج PCR بستگی به انتخاب پرایمر مناسب دارد. طول پرايمرها نیز بسيار مهم است و هر چه طول پرايمر بلند باشد اختصاصي تر عمل مي كند. بهتر است دو پرايمر داراي نقطه ذوب نزديك به هم باشند. غلظت بهینه پرایمرها برای واکنش PCR از 100 نانو مولار تا یک میکرو مولار متغیر است. غلظت بیش از این، منجر به تولید قطعات غیر اختصاصی می شود. طراحی پرایمر نیازمند دقت فراوانی است و نقش بسیار مهمی در امکان پذیر شدن و صحت تکثیر قطعه مورد نظر دارد.

ساعت کاری

بیو وان در تمامی زمینههای آموزشی و پژوهشی با تخصصیترین گروه آماده ارائه خدمات میباشد

  • شنبه تا چهارشنبه : 8.00 صبح - 8.00 عصر
  • پنجشنب : 7.30 صبح - 9.30 عصر
  • جمعه : 7.00 صبح - 10.00 عصر

تماس با ما

آدرس : تهران- میدان انقلاب، خیابان کارگر شمالی،کوی دانشگاه تهران

  • ایمیل :gholamitilko@gmail.com
  • ساعت کاری : 7.30 صبح - 9.30 شب
  • شماره تماس : 09108350291
  • facebook
  • twitter
  • google
  • instagram
تمام حقوق این سایت متعلق به گروه bio1 به سرپرستی پوریا غلامی تیلکو می باشد . نقل مطالب متمم به هر شیوه و با هر عنوان، تخلف محسوب شده و متخلفین بر اساس قوانین جاری کشور مورد پیگرد قانونی قرار می گیرند.