رفع اشکال تخصصی روش بلاتینگ نیمه خشک (سمی درای) | بیوتکنولوژی

امتیاز کاربران

ستاره فعالستاره فعالستاره فعالستاره فعالستاره فعال
 

راهنمای حل مشکلات احتمالی روش بلاتینگ نیمه خشک (سمی درای)

راهنمای حل مشکلات احتمالی روش بلاتینگ نیمه خشک (سمی درای) , انتقال ضعیف , اتصال ضعیف به غشای نیتروسلولز, حساسیت کم تشخیص و یا واکنش پذیری کم, Troubleshooting Semi dry

مطالب مرتبط:

روش بلاتینگ نیمه خشک (سمی درای) | Semi-dry blotting

وسترن بلات(Western blot) |توضیح کامل تئوری و مراحل عملی|بیوتکنولوژی

رفع اشکال تکنیک وسترن بلات(Western blot)|بصورت کامل و تخصصی | بیوتکنولوژی

 

انتقال ضعیف

 

  • زمان انتقال کم می باشد.بهتر است که زمان انتقال را زیاد کرد.
  • نسبت بار به جرم غلط می باشد. پروتئین ها نزدیک به نقطه ایزوالکتریک خود در PH بافر دارای انتقال ضعیف می­باشند. برای رفع این موضوع بهتر است به منظور افزایش انتقال پروتئین ها از بافر دارای خواص اسیدی و یا قلیایی قوی تر استفاده کرد.
  • کاغذ صافی بسیار خشک می­باشد. یا کاغذ در بافر کم و ناکافی خیس خورده است. یا در همان ابتدای عمل انتقال بافر خشک شده است. بهتر است که قبل از عمل انتقال کاغذ صافی کاملا در بافر خیسانده شود. تعداد صفحات کاغذ صافی را افزایش دهید، و یا از یک کاغذ صافی ضخیم تر استفاده کنید.
  • جریان پاور افت می کند. فیوزهای آن را بررسی نمایید.
  • درصد ژل خیلی زیاد می­باشد. T (جمع مونومرها) و یا C (کراس لینکر ها) را کاهش دهید. در C به مقدار 5% کوچکترین اندازه منافذ تولید می شود. با کاهش از این مقدار، اندازه منافذ بزرگتر خواهد شد و کیفیت انتقال بهتر خواهد شد.
  • متانول موجود در بافر،موجب محدودیت عمل شستشوی پروتئین ها از ژل می شود. خارج نمودن متانول کیفیت انتقال بهتر خواهد شد، اما این عمل همچنین سبب کاهش اتصال به نیتروسلولز خواهد شد. از PVDF استفاده کنید.
  • پروتئین در ژل رسوب کرده است. سعی کنید از SDS در بافر انتقالی استفاده کنید. SDS می­تواند کیفیت انتقال را بهتر کند، اما می­تواند کیفیت اتصال به نیتروسلولز را کاهش دهد و نیز واکنش پذیری بعضی پروتئین ها با آنتی­بادی­ها را کم کند.
  • تماس بین غشای بلات و ژل ضعیف می باشد. حباب های هوا یا رطوبت اضافه بین بلات و ژل قرار می گیرد. با استفاده از پیپت با دقت آن را روی کاغذ صافی به دو جهت غلط دهید تا رطوبت اضافه و حباب های هوا بین ژل و غشا بیرون بروند و تماس کامل حاصل شود. از یک کاغذ صافی ضخیم تر در ساندویچ ژل/غشا استفاده کنید. مطمئن شوید که هیچ گونه حبابی بین کاغذ صافی و ژل موجود نمی باشد.
  • ژل کاملا در بافر انتقالی به تعادل نرسیده است. ژل باید در بافر انتقالی کاملا شسته شود تا از چروکیده شدن یا تورم آن در زمان انتقال جلوگیری شود. مدت زمان شستشو و یا تعداد دفعات شستشو را افزایش دهید.
  • اگر چندین ژل همزمان در حال انتقال می باشند، ممکن است آلودگی متقاطع رخ دهد. برای رفع این مشکل از کیسه دیالیز دارای منافذ کوچکتر استفاده شود تا ساندویچ های ژل/غشا را از هم جدا کند. یا از کاغذ PVDF استفاده کنید تا با کیفیت بالاتری به قطعات کوچک متصل شوند.
  • توان اعمال شده به سیستم انتقالی بالا می باشد. ولتاژ را کاهش دهید. هدایت پذیری بافر را بررسی نمایید. بافری که بدرستی تهیه نشده است موجب اعمال توان اضافی به سیستم انتقالی می شود.

اتصال ضعیف به غشای نیتروسلولز

 

  • جهت انتقال در شرایط بهینه اتصال، پروتئین های جداشده توسط SDS-PAGE نیازمند متانول 20 ٪ هستند. مطمئن شوید که بافر حاوی میزان کافی از متانول می باشد.
  • پروتئین های بزرگتر از 15 کیلودالتون ممکن است به طور ضعیفی به نیتروسلولز 0.45 میکرونی متصل شوند و یا در هنگام آزمون از غشا شسته شوند. بهتر است در اینجا از غشای نیتروسلولزی 0.2 میکرون استفاده شود. می­توان جهت بهبود اتصال، پروتئین ها را با گلوتارآلدهید کراس لینک داد.
  • پروتئین ها را می­توان با SDS، NP-40 و چندین دترجنت دیگر از غشای نیتروسلولز جدا کرد. از دترجنت توین-20 در شستشو و مراحل انکوبه نمودن با آنتی بادی استفاده شود. دترجنت ها را در بافر کامل خارج نمایید و یا میزانشان را کم نمایید. از فیکساسیون با گلوتارآلدهید استفاده شود.
  • SDS موجود در بافرهای انتقالی موجب کاهش کیفیت اتصال پروتئین ها می شود. از متانول 20 ٪ در بافر انتقالی استفاده شود و قبل از انتقال ژل را در بافر متانول به تعادل برسانید.

حساسیت کم تشخیص و یا واکنش پذیری کم

 

  • راهنمای استفاده کیت بررسی شود.
  • اتصال آنتی ژن ناقص است.
  • زمان های واکنش آنتی­ بادی کافی نمی­باشند. زمان های واکنش افزایش یابند.
  • بارگیری نمونه کافی نیست. غلظت پروتئین برده شده بر روی ژل را افزایش دهید.
  • ممکن است به منظور جلوگیری از دناتوره شدن در زمان انتقال، آنتی ژن نیازمند تنظیمات دمایی خاصی باشد. دستگاه های انتقالی تر ساخت دنا ژن تجهیز دارای سیرکولاتور می باشند، بنابراین بهتر است از این نوع انتقال استفاده شود.
  • آنتی ­بادی­های مونوکلونال ممکن است آنتی­ژن دناتوره شده را شناسایی نکنند. اتصال آنتی­بادی­های مونوکلونال و یا پلی کلونال دیگر را بررسی نمایید. پروتئین های نیتیو را بلات نمایید.

 

فیلم آموزشی روش بلاتینگ نیمه خشک (سمی درای) | Semi-dry blotting

 

 

فیلم آموزشی روش بلاتینگ نیمه خشک (سمی درای) | Semi-dry blotting

 

♦♦♦ در صورت داشتن هرگونه سوال در مورد این موضوع برای ما نظر بگذارید (در پایین همین صفحه). در اسرع وقت به تمامی سوالات شما توسط کارشناس مربوطه پاسخ داده خواهد شد. با تشکر ♦♦♦

مطالب مشابه: 

معرفی چند کتاب مهم در زمینه بیوتکنولوژی و مهندسی ژنتیک | دانلود با لینک مستقیم

کامل ترین مجموعه کروماتوگرافی |انواع و روشهای کروماتوگرافی| بیوتکنولوژی

دستگاه فرمانتور | بیوراکتور چیست؟

اصول PCR و کاربردهای آن، طراحی پرایمر

تولید پروتئین نوترکیب مزایا و چالش ها

نوشتن دیدگاه

تصویر امنیتی
تصویر امنیتی جدید

کانال تلگرامی بیوتکنولوژی و زیست شناسی اینستاگرام بیوتکنولوژی, bio1 ریسرچ گیت گوگل اسکولار بیوتکنولوژی لینکدین بیوتکنولوژی
تمام حقوق این سایت متعلق به گروه bio1 به سرپرستی پوریا غلامی تیلکو می باشد . نقل مطالب متمم بدون ذکر منبع، تخلف محسوب شده و متخلفین بر اساس قوانین جاری کشور مورد پیگرد قانونی قرار می گیرند.

جستجو