مطالب مرتبط: 

• توضیح کامل تکنیک SDS-PAGE + رفع اشکال تکنیک الکتروفورز عمودی
• راهنمای کامل الکتروفورز آگارز + تصویری | بیوتکنولوژی
• رفع اشکال کامل و تخصصی الکتروفورز DNA | ژل اگارز| بیوتکنولوژی
• تئوری و مبانی کامل ژل الکتروفورز +تصویری | بیوتکنولوژی
• اصول تکنیک الکتروفورز DGGE (ژل الکتروفورز با گرادیان شیب ماده دناتوره کننده)
• تکنیک الکتروفورز دو بعدی | بیوتکنولوژی
• الکتروفورز پروتئین سرم(SPEP) | روش اجرا | و شرح کامل اجزای سرم پروتئین
• ایزوالکتروفوکوسینگ | IEF | بیوتکنولوژی | الکتروفورز با نقطه ایزوالکتریک

تئوری و مبانی ژل الکتروفورز

ژل الکتروفورز یک متود جداسازی و آنالیز ماکرومولکول­های زیستی ( DNA، RNA و پروتئین­ها ) و قطعات آنها بر اساس اندازه و بار می­باشد. این تکنیک در آزمایشگاه های تشخیصی جهت جداسازی پروتئین­ها با استفاده از بار و یا اندازه شان مورد استفاده قرار می­گیرد و در بیوشیمی و دیگر گرایش­های علوم سلولی و مولکولی به منظور جداسازی قطعات دارای اندازه­های مختلف DNA و RNA و مولکول­های پروتئینی بر اساس سایز می­باشد. مولکول­های اسید نوکلئیکی با اعمال یک میدان الکتریکی در ژل آگارز و گاها ژل اکریل آمید حرکت می­کنند و بر اساس اندازه جدا می­شوند. مولکول­های کوچک­تر سریعتر از مولکول­های بزرگتر حرکت می­کنند؛ این امر به دلیل مهاجرت راحت­تر آنها در منافذ ژل می­باشد. اما پروتئین­ها بر اساس بار­شان در آگارز جدا می­شوند زیرا منافذ ژل بسیار بزرگ­تر از آن هستند که بتوانند پروتئین­ها را غربال نمایند. همچنین تکنیک ژل الکتروفورز می­تواند به منظور جداسازی نانوذرات مورد استفاده قرار بگیرد.

از جمله کاربردهایی که ژل ها در هنگام الکتروفورز بر عهده دارند، مهار نمودن کنوکسیون دمایی ایجاد شده در اثر میدان الکتریکی، غربال­گری و نیز ایجاد تاخیر در حرکت مولکول­ها می­باشد. ژل الکتروفورز DNA معمولا به منظور تجزیه و تحلیل بعد از تکثیر DNA با استفاده از تکنیک PCR به کار می­رود، اما ممکن است به عنوان یک تکنیک جهت آماده سازی برای تکنیک­های دیگر مانند اسپکترومتری جرمی ، RFLP ، PCR ، کلون­سازی ، تعیین توالی DNA و یا ساترن بلاتینگ مورد استفاده قرار بگیرد.

در میدان الکتریکی ایجاد شده توسط منبع تغذیه (Power-Supply ) مواد دارای بار خالص مثبت به سمت قطب منفی و مواد دارای بار خالط منفی به سمت قطب مثبت حرکت می­نمایند.

شکل 1) جهت حرکت مولکول­های DNA در الکتروفورز آگارز

در ژل الکتروفورز آگارز پس از اعمال ولتاژ و جریان مورد نظر، مولکول­های با اندازه بزرگ­تر دارای حرکت کندتری در خلل و فرج ژل آگارز می­باشند. همین اندازه مختلف مولکول­ها موجب ایجاد باندهای مجزا و متفاوتی خواهد شد. معمولا ژل­های انتخاب شده جهت عمل الکتروفورز، از جنس پلی­مر­های دارای قدرت ایجاد پیوند متقاطع (crosslinked polymer) می­باشند که نوع این پلی­مر و نیز میزان نفوذپذیری آن بر اساس نوع ترکیب و وزن خاصی که قرار است جدا گردد، انتخاب می­شود. هنگامی که قرار است پروتئین­ها و یا اسید­های نوکلئیک کوچک از جنس DNA یا RNA جدا شوند، معمولا از غلظت­های متفاوتی ژل اکریل امید و کراس­لینکر استفاده می­شود که ایجاد شبکه­های پلی اکریل آمیدی با اندازه منافذ مختلف ایجاد می­گردند. اکریل آمید نوعی نوروتوکسین می­باشد که باید بسیار با احتیاط استفاده شود. اما زمانی که اندازه اسید­های نوکلئیک از چندصد جفت باز بیشتر گردد ، بهتر است از ژل آگارز جهت جداسازی استفاده گردد. آگارز متشکل از زنجیرهای بودن شاخه و بلند و بدون بار کربوهیدرات می­باشد که کراس لینک نیز ندارند؛ همین امر موجب ایجاد ژل با اندازه منافذ بزرگ برای جداسازی ماکرومولکول­ها می­گردد.

شکل 2) باند ژل الکتروفورز: هر باند نشان دهنده یک مولکول DNA خاص می­باشد که دارای وزن مولکولی ویژه می­باشد. باندهای سمت چپ و راست تصویر نشان­گر ladder می­باشند.

در هنگام عمل الکتروفورز بسته به اندازه و اختلاف وزنی که جمعیت مولکول­ها با هم دارند و نیز میزان ولتاژی که اعمال می­گردد ، زمان الکتروفورز متفاوت خواهد بود. در صورتی که مدت زمان عمل الکتروفورز کم باشد روی هم افتادن باندها و نیز اسمیرهای غیر قابل تمایز قابل مشاهده خواهند بود. اما اگر مدت زمان این عمل زیاد باشد ممکن است مولکول­ها از ژل خارج گردند.

به منظور تشخیص وزن مولکول­های جداشده معمولا مارکرهای وزنی معینی وجود دارند که همگام با ران نمودن نمونه­ها ران می­گردند. این مارکر که به Ladder نیز معروف می­باشند، حاوی مخلوطی از مولکول­های دارای وزن مشخص می­باشند. معمولا نکته­های که در مورد ladderها ضروری می­باشد، این است که متناسب با جمعیت مولکولی که قرار است جدا شود، ladder را انتخاب نمود. این ladder باید حاوی مارکرهای دارای وزن کمتر و نیز بیشتر از مولکولی هدفی که قرار است جدا گردد، باشند. فاصله­ای که یک باند طی می­نماید متناسب است با لگاریتم اندازه مولکول.

شکل 3) مارکر DNA جهت نشان دادن وزن مولکولی باندهای جدا شده. این مارکز دارای 11 باندمشخص می­باشد که دارای توالی­های بین 100 تا 1200 جهت باز می­باشد.

عمل الکتروفورز در بافر صورت می­گیرد تا از تغییرات pH جلوگیری بعمل آورد. در واقع pH فاکتوری بسیار اساسی و مهم در عمل الکتروفورز می­باشد. همان­گونه که پیش­تر گفته شد، الکتروفورز تکنیکی بر اساس بار خالص و وزن مولکول­می­باشد.

انواع ژل

مهمترین انواع ژل مورد استفاده در عمل الکتروفورز ژل آگارز و اکریل آمید می­باشند. هر نوع ژل می­تواند به خوبی برای انواع اندازه­ها و گونه­های آنالیت مورد استفاده قرار بگیرد. ژل­های پلی اکریل آمید معمولا برای پروتئین­ها مورد استفاده قرار می­گیرند و نیز دارای قدرت تفکیک خیلی بالایی برای قطعات DNA با اندازه بین 5-500 جفت باز می­باشند. از طرف دیگر ژل­های آگارز دارای قدرت تفکیک کمتری­ برای DNA می­باشند ولی دارای طیف وسیع­تری از جداسازی می­باشند و بنابراین برای قطعاتی DNA بین 50 تا 20000 جفت باز مناسب می­باشند. اما باید این نکته در نظر گرفته شود که برای قطعات DNA بزرگتر از 6مگاباز باید با دستگاه الکتروفورز PFGE(PULSED FIELD GEL ELECTROPHORESIS) قطعات را جدا نمود.

نحوه تهیه این ژل­ها نیز با هم متفاوت می­باشد. برای تهیه آگارز باید آن را به صورت محلول حرارت داد، اما برای تهیه پلی اکریل آمید باید آن را به طریق پلیمریزاسیون با استفاده از ماده شیمیایی تهیه نمود.

ژل­های آگارز دارای منافذ با اندازه­های متفاوت می­باشند ولی برای جداسازی پروتئین­های با اندازه بیشتر از 200 کیلودالتون می­توانند مورد استفاده قرار بگیرند. فاصله بین باندهای DNA دارای طول متفاوت متاثر از میزان درصد آگارز می­باشد. اغلب ژل­های آگارز از درصد ژل بین 0.7 درصد (برای جداسازی قطعات DNA  بین5 تا 10 کیلو باز )و 2 درصد (برای جداسازی قطعات بین 0.2 تا 1 کیلو باز) می­باشند. ژل­های با درصد آگارز بالاتر از 3 ٪ را می­توان برای جداسازی قطعات خیلی کوچک استفاده نمود؛ اما برای این قطعات بهتر است از ژل پلی اکریل آمید به صورت عمودی برای جداسازی آنها استفاده شود. برای بسیاری از جداسازی­ها ژل 1 ٪ آگارز بهترین مورد می­باشد.

شکل 4) ژل آگارز تهیه شده و آماده برای بارگذاری نمونه. پس از حرارت دادن آگارز تا دمای ذوب کامل، آن را در همان حالت مذاب به داخل ژل تری (Gel-Tray) می­ریزند. قبل از ریختن ژل، شانه را در محل تعبیه شده در ژل تری قرار می­دهند، تا پس از سرد شدن و بسته شدن ژل آگارز چاهک­ها به صورت مشخصی تشکیل شوند.

ژل­های پلی اکریل آمید (PAGE) به دلیل اندازه منافذ یکنواختی که درست کرده­اند ، برای جداسازی پروتئین­های با اندازه بین 5 تا 2000 کیلودالتون مناسب می­باشند. اندازه منفذ با تغییر میزان پودر اکریل آمید و بیس اکریل آمید بکار رفته در تهیه ژل تغییر میکند. این نوع ژل به دلیل ماهیت مواد اولیه خود که خطر آفرین می­باشند کاربری کمتری نسبت به قبل دارد و بیشتر جهت جداسازی پروتئین­ها مورد استفاد قرار می­گیرد.

در هنگام تهیه ژل اکریل آمید دو نوع ژل تهیه می­شود: ژل Stacking و ژل Resolving .

ژل Stacking بر روی ژل Resolving ریخته می­شود و درصد آن 5 ٪ می­باشد. ولی ژل Resolving بین 6 تا 15 درصد تهیه می­گردد. درصد انتخاب شده در این نوع ژل به اندازه پروتئین هدف بستگی دارد. هرچه که وزن آن کمتر باشد درصد اکریل آمید بکار برده بیشتر خواهد بود.

شکل 5) شماتیک الکتروفورز پروتئین.

نشاسته

نشاسته بدست آمده از سیب زمینی که به صورت نیمه هیدرولیز گردیده است نیز می­تواند محیطی مناسب و غیر سمی جهت جداسازی پروتئین­ها ایجاد نماید. در این نوع ژل پروتئین­های غیردناتوره می­توانند بر اساس بار و وزن جدا شوند. ژل نشاسته معمولا بین 5 تا 10 درصد می­باشد.

شرایط ژل

دناتوره نمودن

دناتوره نمودن ژل­ها معمولا در شرایطی که ساختار طبیعی آنالیت به هم ریخته می­شود و به صورت خطی در می­آید، ایجاد می­شوند. هنگامی که ماکرو مولکول­ها دناتوره می­گردند، حرکت آنها بر روی ژل تنها به اندازه خطی و نیز نسبت جرم به بارشان بستگی خواهد داشت. بنابراین ساختارهای دوم، سوم و چهارم آنها از بین خواهد رفت که تنها ساختار اولیه جهت آنالیز باقی خواهد ماند. اسیدهای نوکلئیک اغلب با افزودن اوره در بافر دناتور می­گردند، اما پروتئین­ها با استفاده از سدیم دودسیل سولفات (SDS) دناتوره می­گردند که این در واقع قسمتی از ژل SDS-PAGE خواهد شد. به منظور دناتوراسیون کامل پروتئین­ها ، لازم است باندهای دی­سولفید آنها که ایجاد پیوند کوالان کرده­اند و ساختار سوم و چهارم آنها را پایدار نموده است توسط یک روش به نام Reducing PAGE از بین برود. معمولا با استفاده از بتا مرکاپتو اتانول و یا دی­تیوتریتول این باندها شکسته می­شوند. Reducing PAGE معمول­ترین شیوه رایج الکتروفورز پروتئین می­باشد.

شکل 6) نحوه خطی سازی پروتئین­ها در تکنیک SDS-PAGE

در اسیدهای نوکلئیک شرایط دناتوره برای تخمین دقیق وزن مولکولی RNA ضروری می­باشد. مولکولهای RNA قادراند برهمکنش­های درون مولکولی بیشتری نسبت به DNA ایجاد کنند که این امر بر روی تحرک الکتروفورزی آنها تاثیر بسزایی خواهد داشت. اوره، DMSO و گلای اکسال معمولترین عوامل دناتوره کننده برای تخریب ساختار RNA می­باشند.

ژل Native

ژل ­های native در شرایطی غیر-دناتوره کننده ران می­شوند ، بنا براین ساختار طبیعی آنالیت حفظ می­شود. این امر موجب تاثیر گذاری شکل مولکول در تحرک آن خواهد شد و بنابراین هر چهار سطح پروتئین قابل بررسی خواهند بود. از آنجایی که در این نوع ژل­ها ساختار طبیعی پروتئین­ها حفظ می­شود، نتنها می­توان آنها را استفاده از روش­های رنگ آمیزی معمول بررسی نمود، بلکه همچنین می­توان با استفاده از روش­های رنگ آمیزی ویژه enzyme-linked آنها را بررسی نمود. ژل الکتروفورز native معمولا برای تحقیقات پروتئومیکس و متالومیکس مورد استفاده قرار می­گیرد. اگرچه، native-PAGE نیز می­تواند برای اسکن ژل­های حاوی جهش­های ناشناخته مانند تکنیک SSCP مورد استفاده قرار بگیرند.

بافرها

نقش بافرها در الکتروفورز فراهم نمودن یون­های حامل جریان بین دو قطب و نیز حفظ نمودن pH محیط انجام الکتروفورز می­باشد. بافر تریس- استات- EDTA ( TAE) و بافر تریس- بورات- EDTA (TBE) از جمله مهمترین بافرهای مورد استفاده برای اسیدهای نوکلئیک می­باشند. بافر TAE دارای ظرفیت بافری پایینی می­باشد ، اما کیفیت نتایج آن برای توالی ­های DNA با طول بلند بسیار خوب می­باشد. بافرهای دیگری نیز برای الکتروفورز آگارز استفاده می­شود که از عمومیت کمتری برخوردارند.

اما اغلب جداسازی­های پروتئینی تکنیک SDS-PAGE با استفاده از سیستم DISC بافر صورت می­گیرند که به طرو قابل ملاحظه­ای کیفیت باندهای بدست آماده را افزایش می­دهد.

مشاهده باندهای جدا شده در سیستم الکتروفورز

بعد از اتمام عمل الکتروفورز، باید جهت مشاهده مولکول­های موجود در ژل، آنها را رنگ­امیزی نمود. DNA را می­توان با استفاده از اتیدیوم برماید رنگ آمیزی نمود. این رنگ هنگامی که بین دو رشته DNA قرار می­گیرد، تحت نور فرابنفش ، فلوئورسانس ساتع می­کند.

رنگ­های نقره و کماسی برلیانت بلو جهت مشاهده پروتئین­ها استفاده می­شوند. روش­های دیگری ممکن است جهت مشاهده جداسازی اجزای موجود در ژل استفاده شوند. معمولا به منظور عکس برداری از ژل­های رنگ­آمیزی شده از دستگاه ژل داک استفاده می­کنند.