خالص سازی آنتی بادی اختصاصی علیه آنتی ژن 146sویروس تب برفکی سروتیپ o در خوکچه هندی

امتیاز کاربران

ستاره فعالستاره فعالستاره فعالستاره فعالستاره فعال
 

  خالص سازی آنتی بادی اختصاصی علیه آنتی ژن 146sویروس تب برفکی سروتیپ o در خوکچه هندی

 

سمیه بهمن پور1، سعید زیبایی2،مهرین بلوری مقدم1، مریم ایزدی3،سمانه لعل علیزاده1

 

  • دانشجوی کارشناسی ارشد دانشگاه پیام نور واحد مشهد، مشهد-ایران
  • عضو هيئت علمی مؤسسه تحقيقات واکسن وسرم سازی رازی شعبه شمال شرق،مشهد-ايران
  • دانشجوی کارشناسی ارشد دانشگاه آزاداسلامی واحد تنکابن،تنکابن-ايران.

 

چکیده:

بیماری تب برفکی یک بیماری حاد و شدیداً واگیردار دام و نشخوار کنند گان اهلی است  كه درحال حاضر اقتصادي ترين بيماري ويروسي است كه صنعت دامپروري را تهديد مي نمايد. ويروس عامل بيماري متعلق به جنس آفتو ويروس از خانواده پيكورنا ويريده مي باشد  و داراي 7 سروتيپ بوده و مانند ساير پيكورنا ويروس ها حدود30 نانومتر قطر داشته و فاقد غشاء خارجي است. (6)

در اين بررسي پس از خالص سازي آنتي ژن  146sويرس تب برفكي سروتيپ O با استفاده از گراديان ساكارز دو سر خوكچه هندي توسط 25 ميكرو گرم از آنتي ژن و با استفاده از ادجوانت کامل فروند و سپس ادجوانت ناقص فروند بمدت يك ماه بر اساس پروتكل تزريق ايمن شدند. پس از خونگيري و جدا سازي سرم جهت تایید وجود آنتی بادی اختصاصي از آزمايش هاي آگلوتیناسیون سريع بر روي لام و دات بلات استفاده گرديد. همچنين براي خالص سازی آنتی بادی اختصاصی علیه آنتی ژن 146s ویروس تب برفکی، پس از رسوب ایمونوگلبولین ها  با استفاده از سولفات آمونیوم 40 درصد ، از روش هاي کروماتوگرافی ژل فیلتراسیون G-200 و کروماتوگرافی تبادل یونی استفاده گرديد.  همچنین با استفاده از  SDS page  (الکتروفورز روی ژل پلی اکریل آمید) چگونگي خالص سازي وبا استفاده از آزمايش هاي دات بلات و ساندويچ اليزاي غير مستقيم اختصاصي بودن آنتي بادي توليد شده مورد تاييد قرار گرفت. با توجه به نتايج حاصله همچنين بدليل سرعت روش کروماتوگرافی تبادل یونی استفاده از اين روش توصيه مي گردد.

 

کلید واژه : ادجوانت کامل فروند، ادجوانت ناقص فروند، ویروس تب برفکی، ژل فیلتراسیون، تبادل یونی

 

 

The survey  on preparation and purification of specific antibody against 146 S antigen of FMD virus serotype O

 

Bahmanpoor,S.1,Zibaee,S. 2,Bolori,M.1,Izadi,M.3,Lal Alizade,S1.

 Research Institute, Mashhad, Mashhad-Iran.

3Student of M.Sc of Microbiology, Islamic Azad University Tonekabon branch,Tonekabon-Iran.

 

Foot-and-mouth disease (FMD) is a highly contagious viral disease. It can spread rapidly and affects both domesticated and wild ruminants, as well as pigs. FMD has an economically devastating impact on affected countries because trade barriers are imposed in countries where the disease occurs. To purification of 146S FMDV Ag sub cortical injection of Ag with complete frond adjuvant to laboratory animals (guinea pig) accomplish and then after 28 days  initial blooding and secondary injection with incomplete   frond adjuvant and after 12 days secondary blooding and serum isolation accomplished. By sediment with ammonium sulfate and yon exchange chromatography and gel filtration purified specific Ab for 146S Ag. Specific purified Ab is supported by dot blot and ELISA and western blot method. Purify Ag and specific Ab are used to designing and manufacturing indirect sandwich ELISA to identify FMDV.  The result showed that  guinea pigs produced Anti-body more than rabbits.In 1970 ,G.Tukada used hemaglutasion test with glutar aldehid to identify the content of generate  Anti-body against FMDV.in this test guina pig ,sheep,cow and pork was being used.The Maximom level of Anti-body generation observed in guinea pig

KEY WORD: Compelate Adjuant fround, Incomplate Adjuant, FMDV, Gel filtration chromatogeraphy, Ion echange

 

 

 

مقدمه:

ویروس تب برفکی در چارپایان اهلی نظیر گاو، گوسفند ، بز و نشخوارکنندگان وحشی  گوزن، خوک و فیل و  هفتاد  گونه دیگر از حیوانات وحشی عمدتاً نشخوار کننده  ایجاد بیماری می نماید. بیماری در اسب ، موش، رت و خار پشت دیده نمی شود. خانواده شترها هم حساسیت کمی نسبت به ویروس دارند بيماری تب برفکی از نظر خسارت هائی که به صنعت دام  می زند بسیار حائز اهمیت است.  این بیماری سبب افت تولید بسیار زیادی می شود. میزان واگیری بیماری در جمعیت حساس و کشورهای فاقد بیماری تا 100 درصد می رسد ولی مرگ و میر در آن کم و  مختص دام های جوان تر می باشد. ويروس تب برفكي يكي از ويروس هاي خانواده picorna viride  مي باشد. ويروس تب برفكي  به جنس آفتو ويروس (Aphto virus) تعلق دارد ، داراي 30_27 نانومتر قطر با 220 اسيد آمينه و وزن مولكولي 2200 كيلو دالتون و فاقد غشا‍ء خارجي مي باشد. شكل ويروس گرد ، ثابت سديمانتاسيون ويروسs 140_146 و ويروس واجد  ژنوم RNA تك رشته اي و تك مولكو‍‍لي با مفهوم مثبت ميباشد. اين ويروس هفت سروتيپ متفاوت (A_O_C_SAT1_SAT2_SAT3_Asia1) دارد.(7)

اصولاٌ تمام كشور هاي جهان در ارتباط با اين بيماري داراي 3 وضعيت كلي هستند:

عاری از بیماری

اندميك

اسپوراديك

برخي از كشور ها عاري از بيماري هستند، بعضي ديگر با اعمال واكسيناسيون و قرنطينه بيماري را تحت كنترل در آورده و تنها در مواردي اندك وقوع بيماري در آنها گزارش مي شود و دست آخر كشور هايی كه بيماري در آنها بومي است كنترل بيماري در اين كشور ها كاريست بسيار سخت و پر هزينه و اساس كنترل بر پايه واكسيناسيون جمعيت گاوي است. به علت اينكه كشور ايران در خاور ميانه واقع شده است در نتیجه ويروس مي تواند از كشور هاي همسايه وارد ايران شود.(3،4) بر اين اساس كارهايي در اين رابطه در ايران صورت گرفته است از جمله آن تهيه واكسن مي باشد. بنابراين به علت سرعت شيوع در ايران و سرعت انتقال بيماري و بدليل ماهيت ويروس برای تشکیل تحت تیپ در شرایط فیلد و اجبار در گزینش ویروس های جدا شده از فیلد برای تولید واکسن همچنین بخاطرسرعت واگیری زیاداین بیماری تشخیص به موقع وسریع آن از اهمیت ویژه ای برخوردار می باشد. یکی از معتبرترین تست های تشخیصی که در حال حاضر در مراکز رفرنس جهانی نظیر WRL که در انگلستان وجود دارد استفاده می شود آزمایش الیزا با استفاده از روش ساندویچ الیزای غیر مستقیم می باشد. تولید کیت یاد شده توسط آزمایشگاه رفرنس جهانی تب برفکی انجام می گیرد. این کیت بسیار گران بوده و قیمت یک کیت حدودا 5000 دلار می باشد. نظر به آندمیک بودن ایران و منطقه نسبت به بیماری تب برفکی و با توجه به وارداتی بودن کیت تشخیصی اجرای طرح حاضر جهت حصول به دانش فنی کیت مورد اشاره کاملاً ضروری به نظر می رسد. یکی از اولین گام های تولید کیت یاد شده تهیه آنتی بادی اختصاصی بر علیه ویروس می باشد.

بر این اساس نياز به گزينش ويروس جهت ساخت واكسن داريم كه برا ي اين كار نياز است ويروس سريع تشخيص داده شود در نتیجه ما نياز به اليزا داريم.(4)

بر روي ساخت كيت تا كنون در ايران كاري صورت نگرفته است. اما برا ي تشخيص بيماري هم اكنون مركز تشخيص بيماري هاي سازمان دامپزشكي كل كشور از كيت اليزاي خارجي استفاده مي كند. همچنين بخش توليد واكسن تب برفكي موسسه رازي در اين زمينه كارهايي انجام داده است. همچنین بر روی جداسازی و شناسایی سرولوژیکی و مولکولی ویروس تب برفکی از گاوهای استان خراسان رضوی کار شده است.(4)

ويروس تب برفكي سروتيپ o براي اولين بار در سال 1335 در ايران جدا شد و از آن پس  همه ساله همه واگيري هاي متعددي در اثر اين تيپ بروز مي كند و هم اكنون نيز از ويروس هاي مهم در گردش محسوب مي شود. شيوع سال 1350 اين تيپ با همه گيري چشم گير و ضايعاتي فراوان در كشور همراه بوده است(10،3) . از آن سال كشور هر ساله با وقوع مواردي از تب برفكي ناشي از سروتيپ o روبرو مي باشد. در اواخر سال 1388 و اوايل سال 1389 نوع خاصي از بيماري تب برفكي ظاهر شد كه داراي علائم كلينيكي بيشتر، بخصوص در گوساله ها و بره ها بود و حتي در بره ها مرگ و مير بيشتري مي داد. از اپيدمي هاي ناشي از ويروس سروتيپ o كه توسط محققين موسسه رازي جدا گرديد به 0100 در ايران معروف شد و عليه آن واكسن تهيه گرديد. در حال حاضر متداول ترين تيپ در گردش ايران تيپ O مي باشد. همچنين بيشترين تيپ ويروس تب برفكي جدا شده از نمونه هاي ارسالي به آزمايشگاه مرجع جهاني(WRL)، اين سروتيپ مي باشد.(14،1) بيشترين شيوع را در خاورميانه داشته و به عنوان برجسته ترين و گسترده ترين سروتيپ در بين ساير سروتيپ ها مطرح مي باشد. اين نوع ويروس به 10 تا 11 تحت تيپ آنتي ژنيك تقسيم بندي مي شود اگرچه كه اكنون مشخص شده است كه دگرگوني آنتي ژنيكي اين سروتيپ از آنچه تصور مي شده است وسيع تر نيست و چند سويه واكسن به طور نسبي قادر به محافظت عليه بيشتر همه گيري ها مي باشد. هر چند اختلافات ژنتيكي بسيار زياد است و اين امر اجازه دسته بندي چندين دودمان جداگانه را مي دهد. سروتيپ o به علت تهاجمي بودن و همچنين كنترل سخت آن با واكسيناسيون شهرت بسيار زيادي دارد. اما با اين حال تا كنون هيچ توضيح ژنتيكي براي حالت تهاجمي اين سروتيپ بيان نشده است.(15) بك و استروماير در سال 1987 نشان دادند كه اغلب ويروس هاي تيپ o تب برفكي كه بين سال هاي 1980-1970 از اپيدمي هاي اروپا جدا شده اند، ارتباط نزديكي با ويروس هاي تيپ o واكسن دارند كه در آن زمان در ساخت واكسن مورد استفاده قرار مي گرفتند. اين دو دانشمند همچنين ويروس هايي را جدا كردند كه با سويه هاي واكسن ارتباط نزديكي نداشت واظهار كردند كه اين سويه ها از خارج از اروپا به اين منطقه وارد شدند. موارد تالييم اتريش در 1981 و ووپرتال آلمان غربي در 1982 از آن جمله مي باشند كه يك سويه غير تيپيك از سروتيپ o ويروس تب برفكي همه گيري هائي را در خوك ايجاد نمود. در بررسي هاي سرولوژيكي ويروس هاي جدا شده مشخص گرديد كه اين ويروس ها تفاوت قابل ملاحظه اي با سويه هاي اروپايي دارند. اما تا ظهور اپيدميولوژي مولكولي مشخص نبود كه اين ويروسها ارتباط نزديكي با ويروس هايي دارند كه معمولا به چين و هنك كنگ محدود مي شوند.(16،14،2،1) به تازگي 8 دودمان تكاملي از ويروس تب برفكي سروتيپ o توصيف شده است. ذرات s 146 حاوي يك مولكول RNA ويروسي و 60 كپي از هر 4 پروتئين ساختاريVP1-4 مي باشد. به طوري كه پروتئين VP4 به صورت دروني قرار دارد و به محض تفكيك ويريون به ذرات s12  از ذره كامل آزاد مي شود.

ذره كامل ويروس از نظر دماي ذوب و PH ناپايدار مي باشد. بنابراين با حرارت دادن ذره s 146 تا دماي 30 دقيقه ويا در PH كمتر از 5/6 باعث مي شود كه كپسيد ويروس متلاشي شود و RNA عفوني، مولكول هاي متراكم VP4 و يك زيرواحد s 12 كه شامل 5 كپي از هر يك از پلي پپتيدهاي VP1 ،VP2  و VP3 است ايجاد مي شود. همه اين 3 پروتئين به عنوان شاخص هاي آنتي ژنيك روي سطح ويروس شركت دارند اما فقط VP1 تجزيه شده نشان داد كه آنتي بادي خنثي كننده را تحريك مي كند. عمدتا ً توليد آنتي بادي هاي خنثي كننده در ارتباط با ذره s146 مي باشند درحالي كه ذرات s12 باعث توليد آنتي بادي هايی مي شوند كه فعاليت خنثي كنندگي پاييني دارند. به عنوان مثال : تلقيح يك دوز محتوي ماكروگرم ويروس تب برفكي ذره 146s غيرفعال شده بااستيل اتيلن آمين (AEI) به خوكچه هندي، توليد آنتي باد هاي خنثي كننده را براي محافظت برعليه ويروس تحريك مي كند. درصورتي كه 2 دوز محتوي حداقل 5 ماكروگرم از هر يك از زيرواحدهاي s12 براي توليد همان مقدار از آنتي باد خنثي كننده مورد نياز است.

در مورد ويروس تب برفكي يك دليل قاطعانه وجود دارد كه ذره s146 براي تحريك كردن ايمني محافظت كننده ضروري مي باشد.(6) در فرايند توليد آنتي بادي هاي پلي كلونال، مولكولي كه آنتي سرم يا آنتي بادي بر عليه آن توليد مي شود، آنتي ژن و حيواني كه به عنوان مخزن توليد آنتي بادي در نظر گرفته مي شود، ميزبان مي نامند.

در توليد آنتي بادي پلي كلونال، ميزان خلوص آنتي ژن از اهميت خاصي برخوردار است. در حقيقت هر چه درجه خلوص آنتي ژن مورد استفاده براي ايمونيزاسيون بيشتر باشد، ميزان آنتي بادي هاي ناخواسته يا غير اختصاصي كمتر خواهد بود.در طي فرايند آماده سازي آنتي ژن، گاهي شرايط آن باعث ايجاد سميت در در داخل بدن حيوان مي شود. براي مثال استفاده از سديم آزايد و يا حضور آندو توكسين هاي ميكروبي مي توانند علاوه بر آسيب به سلامتي حيوان، ميزان آنتي بادي توليد شده را كاهش دهند بنابراين اين نكات بايد قبل از تزريق مد نظر قرار گيرند.مواردي از اين نوع آنتي بادي ها در كارهاي تحقيقاتي استفاده مي شوند.براي مثال جهت تشخيص مولكولها در آزمايشات تشخيصي اليزا و در وسترن بلات، در ايمونوهيستوشيمي و در ميكروسكوپهاي ايمونوفلورسانس و ايمونوالكترون وغيره از آنتي بادي هاي پلي كلونال استفاده مي شود. سرم معمولاً از طريق تزريق ايمونوژن(آنتي ژن) درون بدن حيوان مورد نظر توليد مي شود.اغلب آنتي ژن جهت افزايش پاسخ ايمني همراه با ادجوانت به حيوان تزريق مي گردد.ميزان آنتي بادي با تزريق افزايشي آنتي ژن در مراحل بعدي افزايش مي يابد(تزريقات افزايشي آنتي ژن مي تواند در حضور ادجوانت و يا بدون ادجوانت صورت بگيرد كه بيشتر در مراحل بعدي تزريق از ادجوانت ناقص فروند استفاده مي شود)براي ارزيابي سطح آنتي بادي ها خونگيري از حيوان پس از طي يك زمان معين صورت مي گيرد و زمانيكه به يك مقدار بالايي از آنتي بادي  با كارائي كافي رسيديم آنتي سرم تهيه مي شود.با انجام سانتريفيوژ سرم از خون جدا شده و در صورت نياز با انجام تكنيك هاي خالص سازي آنتي بادي ها از سرم جدا مي شوند.تكنيك هاي علمي گذشته كه توليد پاسخ ايمني هومورال را شامل مي شوند در توسعه رويه هاي استاندارد مناسب براي آنتي ژن هاي اختصاصي ضروري مي باشند.(11،5)

بهبودي دام مبتلا به تب برفكي با ايجاد پادتن در ارتباط است. آنتي بادي IgM كه در مراحل اوليه عفونت توليد مي شود اولين آنتي بادي مي باشد كه بر عليه ويروس تب برفكي ايجاد مي شود. اين آنتي بادي 4 روز پس از آلودگي قابل تشخيص مي باشد كه اوج توليد اين آنتي بادي پس از 14-7 روز مي باشد. وپس از 30 روز توليد آن كاهش مي يابد. آنتي بادي هايIgM  اوليه تيپ هومولوگ ويروسي را خنثي كرده بنابراين ابتلا به يك تيپ ايمني در برابر ساير سروتيپ هاي ديگر را ايجاد نمي كند ولي از شدت بروز علائم باليني ناشي از ابتلا به ساير سروتيپها مي كاهد. آنتي بادي IgM پايداري زيادي ندارد ولي در خوك تا 6 ماه پس از آلودگي قابل شناسايي مي باشد (7).

 ولي آنتي بادي IgG كه در دوره نقاهت بيماري توليد مي شود اختصاص تيپ است و با درجات متفاوتي، اختصاصي تحت تيپ نيز مي باشد. در مورد نقش ايمني سلولي در بهبودي از بيماري اطلاعات كمي وجود دارد، اما مانند ساير عفونت هاي پيكورناويروسي، تصور مي شود نقش اندكي در بهبودي دام مبتلا داشته باشد تعيين دوام ايمني بدنبال عفونت طبيعي مشكل است. گاوهايي كه از بيماري تب برفكي بهبود يافته اند معمولاً در برابر عفونت با همان تيپ براي يك سال و يا بيشتر ايمن هستند اما ايمني در برابر بيماري تا آخر عمر دوام ندارد. دام هاي بهبود يافته ممكن است فوراً به تيپ ديگري مبتلا شوند و علائم درمانگاهي بيماري را بروز دهند.

توليد آنتي بادي IgG از روز10 – 14 پس از آلودگي شروع شده و پس از حدودا ً 28 روز به اوج خود مي رسد. توليد آنتي بادي در دوران نقاهت بيماري قادر به خنثي كردن تيپ هاي ويروسي بطور اختصاصي است و تا حدي هم برعليه تحت تيپ ها مؤثراست. اين آنتي بادي توانايي ثبوت عناصر مكمل را دارد.

IgG تا چندين ماه پس از عفونت در سطح بالايي باقي مي ماند و تا سال ها نيز قابل رديابي مي باشد. بدين خاطر گاوها پس از بهبودي بيش از يكسال و شايد حداكثر 5/4 سال دربرابر همان تيپ از ويروس كه به آن آلوده شده اند مقاومند، اما اين ايمني مادام العمر نمي باشد.

آنتی‌بادیها مانند سایر پروتئینها از نظرخواصی چون قابلیت انحلال در محلولهای نمکی غلیظ، بار الکتریکی، وزن مولکولی و آنتی ژینیسته قابل بررسی هستند. بنابراین جهت خالص سازی آنتی بادی ها می توان از روش های رسوب آنتی بادی با نمک(آمونیوم سولفات) و کروماتوگرافی تبادل یونی و ژل فیلتراسیون استفاده کرد.

 

 

مواد و روشها :

آنتي ژن 146s ويروس تب برفكي سروتيپ O از موسسه تحقيقات واكسن و سرم سازي رازي شعبه شمال شرق كشور تهيه گرديد. اين آنتي ژن بر اساس پروتكل مورد تاييد WRL با استفاده از روش گراديان ساكارز تهيه شده است. براي تاييد خالص بودن آنتي ژن از بررسي پروتئين هاي توليدي به روش SDS Page و نيز دات بلات  با استفاده از آنتي بادي اختصاصي استاندارد استفاده گرديد.

 

 خالص سازی , آنتی بادی اختصاصی, علیه آنتی ژن 146s, ویروس تب برفکی,  سروتیپ o در خوکچه هندی, ادجوانت کامل فروند، ادجوانت ناقص فروند، ویروس تب برفکی، ژل فیلتراسیون، تبادل یونی , Compelate Adjuant fround, Incomplate Adjuant, FMDV, Gel filtration chromatogeraphy, Ion echange ,  آزمايش لكه گذاري آنتي ژن,  ( دات بلات) ,براي تاييد وجود آنتي بادي, کروماتوگرافی تعویض یونی, با استفاده از ژل,  DEAE Cephadex , انجام کروماتوگرافی تعویض یونی, تخمين ميزان IgG , حاصل از كروماتوگرافي, ژلي و تبادل يوني,

 

ايمن نمودن خوكچه هندي براي توليد آنتي بادي اختصاصي :

بدين منظور دو سر خوكچه هندي با وزن 600 گرم انتخاب شدند. ميزان 80 ميكروليتر از آنتي ژن خالص شده به روش گراديان ساكارز (معادل 10 ميكروگرم آنتي ژن 146s ويروس تب برفكي سروتيپo  ) همراه با 1920 ميكروليتر بافر تريس 05/0 مولار و دو ميلي ليتر ادجوانت كامل فروند(شركت بيوژن) مخلوط و سوسپانسيون تزريقي به ميزان 4 ميلي ليتر آماده شد.

تزريق ثانويه:

پس از گذشت 28 روز از زمان اولين تزريق، تزريق دوم به روشی که برای تزریق اول توضیح داده شده است انجام شد. در تزریق دوم به جای ادجوانت کامل فروند از ادجوانت ناقص فروند استفاده گردید.

خونگيري:

پس از گذشت 40 روز از زمان اولين تزريق(12 روز پس از تزریق ثانویه)، خونگيري از قلب خوكچه انجام گرفت.

آزمايش آگلوتيناسيون سريع روي لام :

اين روش يكي از اولين و ابتدائي ترين روش هاي شناسائي براي تاًئيد وجود آنتي بادي درسرم مي باشد. واكنش اختصاصي بين آنتي ژن تك ظرفيتي و آنتي بادي دو ظرفيتي ( براي IgG) و تجمع اين پيوند منجر به توليد حالتي خاص مي گردد كه به آگلوتيناسيون معروف مي باشد. در اين روش پس از تميز نمودن لام يك قطره از آنتي ژن خالص معادل (حدوداً) 7 ميكروليتر را روي لام قرار داده و سپس يك قطره از سرم به آن افزوده مي گردد. پس از تكان دادن آرام براي مخلوط شدن قطرات و گذاشتن ته لام بر روي پشت دست ( براي گرم شدن لام و افزايش واكنش احتمالي) گلوله هاي كوچك ايجاد شده ( تشكيل آگلوتيناسيون) نشان دهنده مثبت بودن واكنش است و در غير اين صورت يعني عدم وجود آگلوتيناسيون واكنش منفي تلقي مي گردد.

همچنين براي مشاهده بهتر آگلوتيناسيون مي توان از ميكروسكوپ نوري با بزرگ نمايي 4×  يا 10× استفاده نمود.

 آزمايش لكه گذاري آنتي ژن ( دات بلات) براي تاييد وجود آنتي بادي:

اساس روش نظير تمامي واكنش هاي اختصاصي آنتي ژن با آنتي بادي اختصاصي است . در اين روش كه يك روش كيفي و نيمه كمي است واكنش اختصاصي بين آنتي ژن و آنتي بادي با استفاده از روش رنگ سنجي ( DAB) قابل رويت مي گردد.

مراحل انجام دات بلات به قرار زير مي‌باشد :

1-2 ميكرو ليتر از آنتي ژن 146s خالص شده به روش گراديان ساكارز كه به صورت محلول در بافر تريس 05/0مولار آماده شده بود در دو نقطه از كاغذ نيتروسلولز به فاصله 2 سانتي متر از يكديگر قرار داده مي شود.

2- كاغذ نيتروسلولز آغشته به آنتي ژن را در انكوباتور 37 درجه به مدت 10 دقيقه گذاشته تا خشك شود.

3- پس از خشك شدن ،كاغذ نيتروسلولز داخل محلول اسكيم ميلك يك درصد با pH 4/7 غوطه ور مي گردد .

4- بمدت 30 دقيقه در دماي آزمايشگاه شيك مي گردد.

5- شستشو با PBS حاوي يك درصد توئين 20 بمدت دو دقيقه .

6- غوطه ور نمودن داخل ظرف حاوي آنتي بادي اختصاصي (سرم كه 10 برابر رقيق شده است) بمدت نيم ساعت، كه در شرايط آزمايشگاه بر روي شيكر قرار ميگيرد و به آرامي شيك مي شود.

7- شستشو با PBS  حاوي توئين 20 ( يك درصد ) بمدت 20 دقيقه ( شستشو چهار بار هر باربمدت 5 دقيقه )

8- غوطه ور نمودن داخل محلول كونژوگه خوکچه( با رقت 1 در 1000)

9- شستشو با PBS  حاوي توئين بمدت 20 دقيقه ( چهار بار هر بار 5 دقيقه)

10- غوطه ور نمودن داخل محلول DAB (دي آمينو بنزوئيك اسيد)همراه با H2o2

( 6 ميلي گرم  دي آمينو بنزوئيك اسيد  داخل 10 ميلي ليتر PBS  استريل حل و به آن 6 ميكرو ليتر H2o2 اضافه گرديد)

 اساس روش نظير تمامي واكنش هاي اختصاصي آنتي ژن با آنتي بادي اختصاصي است . در اين روش كه يك روش كيفي و نيمه كمي است واكنش اختصاصي بين آنتي ژن و آنتي بادي با استفاده از روش رنگ سنجي ( DAB) قابل رويت مي گردد.

آزمايش وسترن بلات براي تاييد وجود آنتي بادي اختصاصي(IgG) عليه آنتي ژن 146S ويروس تب برفكي سروتيپO  :

پس از تائيد حضور آنتي بادي در سرم از طريق تست كيفي دات بلات، جهت تشخيص حضور IgG اختصاصي عليه آنتي ژن146S  تست وسترن بلات انجام گرفت. مراحل انجام وسترن بلات به قرار زير مي‌باشد:

1- در ابتدا دو ژل SDS-page تهيه مي شود. در  در هر يك از چاهكها 20 ميكروليتر از نمونه آنتي ژني 146s اعمال مي گردد. پس از اتمام مرحله اول (تهیه ژل های SDS-page ) و رنگ آمیزی نیترات نقره یک عدد از ژل ها و دیده شدن باندهای مورد نظر مرحله بعدی آغاز می گردد.

2- تهیه ساندویچ حاصل از قرارگرفتن ژل اصلی تهیه شده در مجاورت کاغذ نیتروسلولز، که به ترتیب بر روی صفحه سیاه مربوط به دستگاه وسترن بلات پس از قرار گرفتن کاغذ فیلتر، کاغذ صافی قرار گرفته و بعد ژل و در انتها کاغذ نیتروسلولزی بر روی ژل قرار می گیرد. صفحه حاضر داخل تانك وسترن بلات که حاوي میزا ن مناسبی بافر باشد قرار مي گيرد . شدت جریان اعمال شده در این مرحله 100 آمپر می باشد که به مدت  60 دقیقه انتقال آنتی ژن به کاغذ نیتروسلولز طول خواهد کشید.

3- پس از طي اين زمان كاغذ نيتروسلولزي داخل محلول اسكيم ميلك یک در صد بمدت 60 دقیقه قرار مي گيرد.

4- كاغذ نيتروسلولزي با PBS حاوي توئين 20 شسته مي شود تا اتصالات پروتئيني سست از كاغذ نيتروسلولزي جدا شوند. به دنبال آن كاغذ نيتروسلولزي با PBS شسته شده تا توئين از سطح كاغذ جدا گردد.

5- غوطه ور نمودن كاغذ نيتروسلولزي داخل ظرف حاوي آنتي بادي اختصاصي (سرم خوکچه آماده شده با رقت 1 در 500)

6-شستشو با PBS حاوي توئين 20، و به دنبال آن شستشو با PBS

7-كاغذ نيتروسلولزي در محلول آنتی – آنتی بادی  خوکچه کونژوگه با HRP با رقت 1 در 1000 بافر فسفات به مدت60 دقیقه غوطه ور می گردد.

8- رنگ آميزي كاغذ نيتروسلولزي با محلول  DAB ( 10 ميلي گرم  دي آمينو بنزوئيك اسيد  داخل 30 ميلي ليتر PBS  استريل حل و به آن 200 ميكرو ليتر H2o2 اضافه گرديد)

9- مشاهده لکه های قهوه ای رنگ در محل باندهائی از آنتی ژن که در ژل رنگ آمیزی شده با نیترات نقره مشاهده شده بود نشانگر مثبت بودن رنگ آمیزی با DAB می باشد.

ساندويچ اليزاي غير مستقيم:

برای تشخیص نمونه ­ها از  كيت تهیه شده تو سط انستيتو بهداشت دام انگلستان آزمايشگاه پر برايت (Institute for Animal Health Pirbright Laboratory  ) استفاده شد . كيت مورد استفاده بر اساس استاندارد ساندويچ اليزا براي شناسائي آنتي ژنهاي ويروس تب برفكي طراحي شده است .

طبق دستوالعمل کیت مراحل آزمایش صورت گرفت. ارزش متوسط OD  پس از کسر OD(Blank) چنانچه 1/0 یا بیشتر باشد، نمونه مثبت تلقی می­گردد.

خالص سازي آنتي بادي :

براي خالص سازي آنتي بادي از روشهاي رسوب با سولفات آمونيوم، كروماتوگرافي به روش ژل فيلتراسيون (G-200) و كروماتوگرافي تبادل يوني -celloluse DEAEاستفاده گرديد.

خالص سازي IgG با استفاده از رسوب گذاري با سولفات آمونيوم که مراحل کار به قرار ذیل می باشد:

ميزان 2 ميلي ليتر سرم را به مدت 30 دقيقه در دماي 4 درجه سانتي گراد ( در سانتريفيوژ يخچال دار ) با دور 10000g قرار داده و مايع روئي برای مراحل بعد مورد استفاده قرار مي گيرد.

به مایع روئی به ميزان 40% سولفات آمونيوم اضافه مي گردد(به ازاي 10 ميلي ليتر 2.7 گرم سولفات آمونيوم) پس از مخلوط كردن، به مدت 60 دقيقه در يخچال(4 درجه سانتي گراد) قرار داده مي شود.

سانتريفيوژ در 4 درجه سانتي گراد با دور 4000g به مدت 20 دقيقه

مايع روئي حذف شده و رسوب حاصله با 2 ميلي ليتر بافر تريس 20 ميلي مولار با pH 4/7 حل مي گردد.

جهت حذف سولفات آمونيوم محتوي سرم آماده شده را داخل كيسه دياليز ريخته و در برابر بافر تريس 20 ميلي مولار با pH 4/7 به مدت 48 ساعت دياليز مي گردد. پس از هر 12 ساعت از بافر تريس جديد براي دياليز استفاده مي شود.

محتوي داخل كيسه دياليز جمع آوري شده و در 21- درجه سانتی گراد جهت انجام كروماتوگرافي نگه داري مي گردد. جداسازي IgG سرم خوکچه با استفاده از ستون كروماتوگرافي G-200 :

سفادكس G-200 براي جداسازي پروتئين هايي با وزن مولكولي بيش از 800000 دالتون به كار مي رود بنابراين براي جداسازي IgG  بسيار مفيد مي باشد. چون IgG داراي وزن مولكولي بالاست (170 کیلودالتون) ازلابه لاي بيدها عبور كرده و در واقع از فضاي مرده ستون خارج مي گردد(Voild volum).

آماده سازي ژل و ستون:

8 گرم پودر سفادكس G-200 وزن مي شود و در بشر حاوي آب مقطر استريل ريخته تا بيدها كاملآ متورم شوند. پس از شستن ستون با آب مقطر استريل و گذاشتن پنبه اي به عنوان فيلتر در انتهاي ستون، بيدها مرحله به مرحله داخل ستون ريخته مي شوند تا بيدها كاملاً پك شوند.(طول ستون 108 سانتي متر و قطر آن نيز 1.5 سانتي متر تخمين زده شد). پس از آن جريان بافر(بافر تريس 20 ميلي مولار با pH 8) با سرعت مناسب برقرار مي گردد تا شستشوي ستون به خوبي انجام شود و اين كار تا زماني ادامه مي يابد كه جذب بافر ورودي و خروجي ستون يكسان گردد.

اعمال نمونه:

یک ميلي ليتر از نمونه سرم رسوب يافته با سولفات آمونيوم بر روي ژل اعمال مي گردد. جهت جمع آوري فراكسيون ها، لوله ها داخل فراكشن كالكتور قرار گرفته و تعداد قطرات خروجي براي جمع آوري 2 ميلي ليتر (معادل 144 قطره)از نمونه تنظيم مي گردد. جذب فراكسيون هاي جمع آوري شده در اسپكتروفتومتر با طول موج 280 نانومتر خوانده مي شود.

تست براد فورد:

ابتدا اسپكتروفتومتر را در طول موج nm 595 تنظيم كرده و سپس دستگاه  با محلول بلانك(بافر تريس 20 ميلي مولار با pH 8) صفر مي گردد. داخل 5 ميلي ليتر از محلول برادفورد،100 ميكروليتر از نمونه اضافه مي شود. جذب تك تك نمونه ها اندازه گيري مي شوند. سپس با استفاده از نرم افزار اكسل نمودار رسم مي گردد و با استفاده از نمودار استاندارد BSA غلظت پروتئين موجود در نمونه ها اندازه گيري مي گردد.

تعيين ميزان خلوص آنتي بادي به روش  SDS-PAGE:

جهت تشكيل و مشاهده باند مربوط به IgG فراكسيون هاي مورد نظر بر روي ژل الكتروفورز برده مي شوند.

کروماتوگرافی تعویض یونی با استفاده از ژل DEAE Cephadex:

CM-celloluse و DEAE Cephadex هر دو براي جداسازي پروتئين هاي موجود در سرم به كار مي روند. DEAE Cephadex تحت شرايط PH و قدرت يوني به حالت تعادل رسيده كه در اين حالت اجازه مي دهد همه پروتئين هاي سرم به جزء IgG به ستون متصل شوند.

برای انجام آزمایش کروماتوگرافی تعویض یون از ژل DEAE Cephadex استفاده گرديد. یکی ازمزایای این روش این است که در طی یک مرحله انجام گرفته و توسط بافر آغازگر تمامی IgG ها از ستون خارج شده و سایر پروتئین ها جذب ستون می شود

انجام کروماتوگرافی تعویض یونی:

ابتدا ژل با بافر آغازگر (تريس20 میلی مولار با 9 pH=) متعادل گردید. منظور از متعادل شدن یعنی pH محلول خروجی از ستون با pH بافر آغازگر برابر شد.

مقدار نمونه باید حدود 5-1 درصد حجم كل ستون باشد لذا در این روش مقدار 1 میلی لیتر از نمونه دیالیز شده روی ژل اعمال مي شود. پس از اينكه نمونه داخل ستون ريخته مي شود يكبار پس از خارج شدن نمونه، نمونه دوباره وارد ستون مي شود و جريان از پائين قطع مي شود تا به پروتئين هاي موجود در نمونه اين فرصت داده شود كه بعضي كه داراي بار مخالف با بيد هستند متصل شوند. اما ايمونوگلوبين ها در اين pH داراي بار مثبت بوده به ستون متصل نشده و در همان مرحله اول كه تحت عنوان out خوانده مي شود خارج مي گردند. سپس ستون با بافر تريس با pH  هاي مختلف شسته مي شود( بعد از pH  آغازين9 به ترتيب ستون با pH هاي 8.5 و8 و7.5 و7 ودر انتها 6 شسته مي شود و در لوله هايي كه در پائين ستون گذاشته، جمع آوري مي شوند. جذب فراكشن ها در 280 نانومتر در اسپكتروفتومتري خوانده مي شوند و براي مشاهده باند مورد نظر نمونه ها بر روي ژل SDS- page برده مي شوند.

تخمين ميزان IgG حاصل از كروماتوگرافي ژلي و تبادل يوني:

روشي سريع جهت تعيين غلظت آنتي بادي خالص شده، گرفتن جذب در اسپكتروفتومتري در طول موج 280 نانومتر مي باشد. پروتئين هايي كه داراي اسيدآمينه هاي آروماتيك(تريپتوفان و فنيل آلانين و تيروزين) ميباشند در اين طول موج نور را جذب مي كنند. هر پروتئيني يكي از اسيدآمينه ها را دارد كه در اين بين ايمنوگلوبين ها با داشتن بيشترين تعداد از اين اسيد هاي آمينه، بيشترين جذب را دارند.

در صورتيكه محلول ما حاوي 1mg/ml ،IgG باشد، جذب 36/1 را نشان ميدهد براين اساس غلظت IgG سنجيده شد.

دستگاه اسپكتروفتومتري ابتدا با بافر تريس 20 ميلي مولار مورد استفاده در هر دو كروماتوگرافي صفر گرديد. سپس جذب تك تك سرم هاي خالص شده محاسبه گرديد.

 

 

نتايج :

نتايج حاصل از آگلوتيناسيون سريع روي لام:

نتايج حاصل از آگلوتيناسيون سريع روي لام بر روی سرم های گرفته شده از خوکچه هندی نشان داد که این سرم ها دارای آنتی بادی اختصاصی بر علیه آنتی ژن 146S ویروس تب برفکی سروتیپ O می باشند. انجام این تست با آنتی ژن هترولوگ و منفی بودن نتایج، نشان دهنده تایید این تست می باشد.

نتايج حاصل از آزمايش دات بلات آنتي ژن 146s ويروس تب برفكي سروتيپo  و آنتي بادي اختصاصي ايجاد شده در خوكچه هندي)تصویر1)

خالص سازی , آنتی بادی اختصاصی, علیه آنتی ژن 146s, ویروس تب برفکی,  سروتیپ o در خوکچه هندی, ادجوانت کامل فروند، ادجوانت ناقص فروند، ویروس تب برفکی، ژل فیلتراسیون، تبادل یونی , Compelate Adjuant fround, Incomplate Adjuant, FMDV, Gel filtration chromatogeraphy, Ion echange ,  آزمايش لكه گذاري آنتي ژن,  ( دات بلات) ,براي تاييد وجود آنتي بادي, کروماتوگرافی تعویض یونی, با استفاده از ژل,  DEAE Cephadex , انجام کروماتوگرافی تعویض یونی, تخمين ميزان IgG , حاصل از كروماتوگرافي, ژلي و تبادل يوني,

SERUM        CO       - Ab(gel)    Ab(ion exchange)

تصویر1: نتیجه حاصل از دات بلات

ايجاد لكه هاي قهوه اي بيانگر اتصال اختصاصي آنتي ژن به آنتي بادي مي باشد و شدت  ايجاد رنگ قهوه اي با ميزان آنتي ژن رابطه دارد.

نتايج حاصل از آزمايش وسترن بلات آنتي ژن 146s ويروس تب برفكي سروتيپo  و آنتي بادي اختصاصي ايجاد شده در خوکچه هندی:

پس از خارج کردن کاغذ نیتروسلولزی از داخل دستگاه وسترن بلات و رنگ آمیزی کاغذ با محلول DAB ، با مشاهده باندهای مربوط به آنتی ژن 146S ویروس تب برفکی سروتیپ O بر روی کاغذ نتیجه آزمایش مثبت ارزیابی شد. تشكيل باند در محدوده  65 كيلودالتوني نشان مي دهد كه آنتي بادي اختصاصي (IgG) عليه آنتي ژن146s (VP1+VP2) در بدن حيوان توليد شده است.(تصویر2)

خالص سازی , آنتی بادی اختصاصی, علیه آنتی ژن 146s, ویروس تب برفکی,  سروتیپ o در خوکچه هندی, ادجوانت کامل فروند، ادجوانت ناقص فروند، ویروس تب برفکی، ژل فیلتراسیون، تبادل یونی , Compelate Adjuant fround, Incomplate Adjuant, FMDV, Gel filtration chromatogeraphy, Ion echange ,  آزمايش لكه گذاري آنتي ژن,  ( دات بلات) ,براي تاييد وجود آنتي بادي, کروماتوگرافی تعویض یونی, با استفاده از ژل,  DEAE Cephadex , انجام کروماتوگرافی تعویض یونی, تخمين ميزان IgG , حاصل از كروماتوگرافي, ژلي و تبادل يوني,

تصوير2- آخرين مرحله آزمايش اليزا ، پليت آماده قرائت

نتيجه حاصل از واكنش اليزا:

ارزش متوسط OD  پس از کسر OD(Blank) چنانچه 1/0 یا بیشتر باشد، نمونه مثبت تلقی می­گردد.(تصویر1)

خالص سازی , آنتی بادی اختصاصی, علیه آنتی ژن 146s, ویروس تب برفکی,  سروتیپ o در خوکچه هندی, ادجوانت کامل فروند، ادجوانت ناقص فروند، ویروس تب برفکی، ژل فیلتراسیون، تبادل یونی , Compelate Adjuant fround, Incomplate Adjuant, FMDV, Gel filtration chromatogeraphy, Ion echange ,  آزمايش لكه گذاري آنتي ژن,  ( دات بلات) ,براي تاييد وجود آنتي بادي, کروماتوگرافی تعویض یونی, با استفاده از ژل,  DEAE Cephadex , انجام کروماتوگرافی تعویض یونی, تخمين ميزان IgG , حاصل از كروماتوگرافي, ژلي و تبادل يوني,

تصوير3- آخرين مرحله آزمايش اليزا ، پليت آماده قرائت

از آنجا كه ترتيب انجام ساندويچ اليزاي غير مستقيم و نيز كوت كردن درون خانه هاي پليت بترتيب  بصورت آنتي بادي خرگوش و سپس آنتي ‍ژن(نمونه و يا استاندارد) و آنگاه آنتي بادي اختصاصي خوكچه مي باشد و نيز اضافه كردن آنتي آنتي بادي خوكچه و كروموژن براي تمامي خانه هاي پليت يكسان مي باشد. آنتی ژن های گرادیان ساکارز و ژل فیلتراسیون به خوبی توانسته است به جای آنتی ژن استاندارد جواب مثبت حاصل از آزمایش ساندویچ الیزای غیر مستقیم را حاصل نماید و نیزدر سرم های خوکچه هندی  نیز آنتی بادی های خالص شده به روش تبادل یونی و ژل فیلتراسیون نیز توانسته است در جایگزینی با مشابه خود در کیت جواب مناسبی حاصل نمایند. هرچند برای نائل شدن به بهترین رقت آنتی ژن و آنتی بادی به آزمایش های زیادی نیاز می باشد.

پس از تایید حضور آنتی بادی اختصاصی علیه آنتی ژن 146s ویروس تب برفکی سروتیپo ، میزان جذب نمونه های سرم خالص شده به روش کروماتوگرافی تبادل یونی و ژل فیلتراسیون توسط اسپکتروفتومتری اندازه گیری گردید و بر اساس نمودار استانداردBSA و محاسبه میزان آنتی بادی مشخص گردید که نمونه سرم خالص شده به روش کروماتوگرافی تبادل یونی حاوی میزان بیشتر از آنتی بادی می باشد و روش مذکور جهت خالص سازی توصیه می گردد.(جدول1)

 

 

 

 

نوع حيوان

روش خالص سازي

ميزان جذب

ميزان IgG

خوكچه

ژل فيلتراسيون

0.297

1.09 mg/ml

تبادل يوني

0.402

2.36 mg/ml

جدول1: میزان جذب سرم های خالص شده

بحث:

تشخیص ویروس تب برفکی با توجه به سرعت انتشار آن بسیار با اهمیت است چرا که اگر این تشخیص دیر تر از حد معمول انجام پذیرد ویروس مناطق وسیعی را اشغال کرده و سبب خسارات اقتصادی بیشتری می گردد، همچنین مبارزه با آن هزینه زیادی  در بر خواهد داشت. یکی از آزمایشهای مهم تشخیصی که هم اکنون در آزمایشگاههای رفرنس انجام می گیرد آزمایش الیزا است . برای انجام آزمایش از کیت ساندویچ الیزای غیر مستقیم استفاده می گردد که در این کیت از آنتی بادی های اختصاصی سروتیپ های ویروس تب برفکی استفاده می شود. این آنتی بادی ها در خرگوش و خوکچه هندی تهیه می گردد. از خصوصیات آنتی بادی های تهیه شده این است که علاوه بر خالص بودن، اختصاصی برای تعیین سروتیپ می باشند.

هدف از این مطالعه تولید و خالص سازی آنتی بادی اختصاصی علیه آنتی ژن 146s ویروس تب برفکی  سروتیپ o می باشد.

اولین قدم برای تهیه آنتی بادی اختصاصی بر علیه ذره 146s ویروس تب برفکی خالص سازی این ذره می باشد که با استفاده از روش گرادیان ساکارز انجام شده است.

حيوانات آزمايشگاهي انتخاب شده جهت ايمني زائي و توليد آنتي بادي اختصاصي،دو خوكچه هندي به وزن 600 گرم بودند.

جهت ایمن سازی خوکچه هندی نسبت به آنتی ژن های مختلف دستورالعمل استانداردی وجود دارد كه در اين دستورالعمل بعد از تزريق اول، معمولاً تزريقات يادآور بعد از 2 تا 4 هفته انجام مي شوند. معمولاً 48 ساعت بعد از تزريق، خونگيري انجام شده و ميزان آنتي بادي توليد شده بررسي مي شود. تزريق هاي يادآور تا زمان به دست آوردن تيتر قابل قبول تكرار مي شوند(5).

درسال1970 G.Tukuda و همكار او جهت شناسائي ميزان آنتي بادي هاي توليد شده عليه FMDV از تست هماگلوتيناسيون با گلوتار آلدئيد  استفاده كردند. در اين آزمايش از خوكچه هندي ، گوسفند ، گاو و خوك استفاده شد. بيشترين ميزان توليد آنتي بادي در سرم خوكچه هندي مشاهده گرديد كه نشان دهنده اين موضوع است كه خوكچه هندي بهترين حيوان آزمايشگاهي است كه مي تواند آنتي بادي اختصاصي عليه ويروس تب برفكي توليد نمايد)18).

در تحقيقي كه در سال 1980 توسط Cartwright B. و همكاران جهت بررسي ارتباط سرولوژي و ايمونولوژي بين ذرات 146s و 12s ويروس تب برفكي انجام شد از امولسيون ادجوانت فروند كامل و FMDV غير فعال شده با استيل اتيلن آمين 5% (AEI)(با حجم برابر) استفاده گرديد اين محققين از خوكچه هاي هندي 600 گرمي جهت توليد آنتي بادي اختصاصي استفاده كردند. همچنين ايمن سازي از راه تزريق زير جلدي انجام گرفت. نمونه هاي خون بعد از گذشت 10 تا 12 روز از زمان تزريق دوم جمع آوري گرديد(8).

  1. Ismet GURHAN و همكارانش در سال 1999 میلادی براي تایید حضور آنتی بادی اختصاصی علیه آنتی ژن 146S ويروس تب برفكي سروتيپ O از آزمايش هاي وسترن بلات و الیزاي غیر مستقیم استفاده كردند. حضور آنتي بادي اختصاصي با استفاده از اليزا مورد تاييد قرار گرفت. همچنين حداقل 7 باند در نتيجه حاصل از SDS-page آنتي ژن 146s ويروس تب برفكي پس از رنگ آميزي نقره مشخص گرديد كه با نتايج حاصل از وسترن بلات اين مطالعه مطابقت دارد(13).

خالص سازي آنتی بادی اختصاصی با استفاده از رسوب با سولفات آمونيوم، كروماتوگرافي به روش ژل فيلتراسيون از نوع G-200 و كروماتوگرافي تبادل يوني از نوع DEAE-Cephadex(كه يك نوع تبادل كننده آنيوني است)انجام گرفت.

اولين مرحله خالص سازي با استفاده از روش رسوب با سولفات آمونيوم انجام گرفت كه نتيجه حاصل از آن افزايش غلظت آنتي بادي ها بوده و در صد خلوص حاصل از آن پائين مي باشد. جهت حذف نمك سولفات آمونيوم عمل دياليز در بافر  PBS انجام گرفت. همانگونه كه در كتاب خالص سازي و توصيف آنتي بادي ها(2006) نيز آمده است بعد از خالص سازي با سولفات آمونيوم جهت دياليز و حذف نمك استفاده شده از بافر PBS استفاده مي شود.

در سال 1978 ميلادي  Heide, Kوهمكارش از خالص سازي IgG با استفاده از رسوب با آمونيوم سولفات به عنوان اولين راه خالص سازي IgG نام برده است. اين محقق براي خالص سازي IgG از سولفات آمونيوم 40% استفاده نموده است(12).

Neoh, S.H و همكاران نيز در سال 1986 با استفاده از سولفات آمونيوم آنتي بادي هاي مونوكلونال موش را از مايع ميان بافتي خالص نمودند(17).

در مقاله حاضر جهت خلوص بيشتر آنتي بادي اختصاصي توليد شده، سرم رسوب يافته با سولفات آمونيوم، بر روي ستون كروماتوگرافي به روش ژل فيلتراسيون G-200 لود شد. كه نتيجه آن خارج شدن IgG از فضاي مرده ستون مي باشد.

جهت خالص سازي آنتي بادي از روش كروماتوگرافي تبادل يوني (DEAE) cephadex استفاده شد كه باند  IgG در محدوده 170 كيلودالتوني ظاهر گرديد. به دليل اينكه IgG داراي بار مثبت مي باشد براي خالص سازي آن مي توان از روش كروماتوگرافي تعويض يوني با استفاده از بيدهاي داراي بار مثبت ((DEAE) cephadex) استفاده نمود كه در نتيجه IgG در همان ابتدا از ستون خارج مي شود.

وزن مولكولي IgG 170 كيلودالتون عنوان شده است. در صورتيكه رنگ بكار برده شده در  الكتروفورز فاقد مركاپتواتانول باشد باند مورد نظر تشكيل مي شود. شكست پيوند دي سولفيدي بين زنجيره سنگين و سبك موجود در IgG در نتيجه حضور مركاپتواتانول صورت گرفته كه در نتيجه آن دو باند در محدوده 37 كيلودالتوني و 75 كيلودالتوني تشكيل مي گردد(5).

در سال 1965 K. M. Cowan و همكارش جهت توليد آنتي بادي عليه ويروس تب برفكي از خوكچه هندي استفاده كردند. در خوكچه هاي آلوده به ويروس، پس از گذشت زمان 4 روز آنتي بادي هاي 119s- توليد شد كه توسط تست هاي رسوبي در ژل آگار(DID) شناسائي شدند. اين نوع از آنتي بادي ها تنها براي مدت كوتاهي توسط اين تست هاي رسوبي قابل شناسائي بوده و بعد از 15 روز ديگر قابل شناسائي نمي باشند. اين نوع آنتي بادي به شدت جذب (DEAE) cellulose مي گردد همچنين قادر است از ستون كروماتوگرافي Sephadex G-200, به سرعت عبور نمايد. در حدود 10 روز پس از تزريق ويروس، آنتي بادي هايي از نوع2-  7Sتوليد گرديد كه برخلاف آنتي بادي هاي 119s- اتصال ضعيفي به(DEAE) cellulose داشته و به آرامي از ستون Sephadex G-200,  عبور مي نمايند(9).

بطور خلاصه مي توان گفت روش هاي تزريق و توليد آنتي بادي اختصاصي در اين مطالعه بر اساس رفرنس هاي معتبر (WRL) مي باشد. همچنين مي توان گفت با روش تزريق مورد استفاده در اين مطالعه آنتي بادي هاي اختصاصي بر عليه ويروس 146S تب برفكي سروتيپ O ايجاد گرديد كه اين آنتي بادي ها با روش هاي رسوب با سولفات آمونيوم، كروماتوگرافي به روش ژل فيلتراسيون و تعويض يوني خالص شدند. با توجه به نتايج حاصله، روش خالص سازي با استفاده از كروماتوگرافي تعويض يوني توصيه مي گردد. همچنين بايد در نظر داشت كه سرعت و سهولت استفاده از كروماتوگرافي تعويض يوني جهت خالص سازي IgG بسيار قابل توجه مي باشد و نيز مي توان توصيه نمود كه جهت تاييد خلوص آنتي بادي اختصاصي توليد شده بر عليه آنتي ژن 146S ويروس تب برفكي سروتيپ  O مي توان از آزمايش وسترن بلات و يا اليزا استفاده نمود. در مراحل اوليه جهت تاييد حضور آنتي بادي آگلوتيناسيون و دات بلات كارائي دارند. آزمايش ساندويچ اليزاي غير مستقيم جهت تاييد توليد آنتي بادي اختصاصي برعليه آنتي ژن 146S ويروس تب برفكي سروتيپ O نشان داد كه آنتي بادي اختصاصي در خوكچه هندي توليد شده است و نيز نتايج اين آزمايش در مورد آنتي بادي هاي خالص شده به روش هاي تبادل يوني و ژل فيلتراسيون نيز حضور آنتي بادي هاي اختصاصي را تاييد نمودند. در خصوص استفاده از بهترين رقت آنتي ژن وآنتي بادي براي حصول نتيجه بهتر به آزمايش هاي تكميلي بيشتري نياز مي باشد كه از اهداف اين مطالعه محسوب نمي گردد.  

 

 

منابع:

منابع فارسی:

  • ايران منش، و.(1387). بررسي مولكولي قطعه (VP1)1D ژنوم ويروس تب برفكي سروتيپO جدا شده از استان خراسان رضوي، پايان نامه دانشجوئي موسسه تحقيقات واكسن و سرم سازي رازي.

 

  • بهاري،ا.(1383). بررسي فراواني حاملهاي ويروس تب برفكي در گاوهاي ذبحي كشتارگاه زياران، دانشگاه تهران، پايان نامه دكتري تخصصي، شماره 192 سال تحصيلي 84-1383.
  • رفيعي كركوندي، عليرضا.(1378).بيماري تب برفكي، سازمان دامپزشكي كل كشور، معاونت بهداشتي و پيشگيري، بهار1378.

 

  • زيبائي،س. (1385). جداسازي و شناسائي سرولوژيكي و مولكولي ويروس تب برفكي از گاوهاي استان خراسان رضوي، پايان نامه دكتري تخصصي ميكروبيولوژي، شماره 253، سال تحصيلي 85-1384
  • وارسته، ع. (1387). روش هاي عملي در ايمونولوژي. چاپ دوم.

منابع انگلیسی:

6) A . F .Murphy , E . P .J . Gibbs , M. C. Horzinek, M. J. Studdert, “Picornaviridae in veterinary viorology” , 3th Ed., Academic Press London, 1999, 517-528.

7) Aggarwal. N., and P. V. Barentt(2002). Antigenic sites of Foot and Mouth Disease Virus : an analysis of the specificities of anti-FMDV antibodies after vaccination of naturally susceptible host species. Journal of General Virology,83, 775-782.

  8) Cartwright. B.,  D. J. Morrell and F. Brown (1982). Nature of the Antibody Response to Foot and Mouth Disease Virus Particle, its 12s Protein Subunit and the Isolated Immunizing Polypeptide VP1 , 63, 375-381.

  9)  Cowan. K. M. and R. Trautman (1965). Antibodies Produced by Guinea Pigs Infected with Foot-and-Mouth Disease Virus, 94, 858 -867.

10)  Eleonora Market, F. Nina Papavasiliou (2003) V(D)J Recombination and the Evolution of the Adaptive Immune System PLoS Biology1(1): e16

11)  Francis,M.J.,Fry,C.M.,Rowlands,D.J.and Brown,F.(1988):Qualitative and differencese in the immune response to Foot-and-mouth disease virus antigens and synthetic peptid.J.Gen.Virol.69:2483-2491.

12) Heide, K.and Schwick, H. G. (1978) Salt fractionation of immunoglobulins, in Handbook of Experimental Immunology, 3rd ed.(Weir, D. M., ed.), chap. 7. Blackwell Scientific, Oxford, UK

13) Ismet GURHAN. S., Burhan Gorhan, Gulhan Aynagoz, Nilay Onal, Gulnur Onver.(1999). Characterization of Monoclonal Antibodies Against Foot and Mouth Disease Virus and Determination of AntegenicVariations in Field Strains.403-408.

14)  J.Panyam, V. Labhasetwar, “Biodegradable Nanoparticles for  Durg and Gene Delivery to cells and Tissue” , Advanced Durg Delivery Reviews, 55(2003) 329-347.

15) Litman GW, Rast JP, Shamblott MJ (1993). "Phylogenetic diversification of immunoglobulin genes and the antibody repertoire". Mol. Biol. Evol. 10 (1): 60-72

16)  Mahy B.W.J.(2005). Foot-and-Mouth Disease Virus: 288 Current Topics in Microbiology and Immunology. CTMI (2005) 288. Springer (New York).

17)  Neoh, S. H., Gordon, C., Potter,A., and Zola, H. (1986) The purification of mouse MAb from ascetic fluid. J.Immunol.Meth. 91,231.

18)  Tukuda. G.,  and R. E. WARRINGTON(1970). Detection of Foot and Mouth Disease Virus Antibodies. American society for Microbiology, p, 35-39

 

 

نوشتن دیدگاه

تصویر امنیتی
تصویر امنیتی جدید

کانال تلگرامی بیوتکنولوژی و زیست شناسی اینستاگرام بیوتکنولوژی, bio1 ریسرچ گیت گوگل اسکولار بیوتکنولوژی لینکدین بیوتکنولوژی
تمام حقوق این سایت متعلق به گروه bio1 به سرپرستی پوریا غلامی تیلکو می باشد . نقل مطالب متمم بدون ذکر منبع، تخلف محسوب شده و متخلفین بر اساس قوانین جاری کشور مورد پیگرد قانونی قرار می گیرند.

جستجو