مطالب مشابه:

• الکتروفورز
• اصول PCR و کاربردهای آن، طراحی پرایمر
• وسترن بلات(Western blot) |توضیح کامل تئوری و مراحل عملی|بیوتکنولوژی
• راهنمای کامل الکتروفورز آگارز + تصویری | بیوتکنولوژی
• الکتروفورز پروتئین سرم(SPEP) | روش اجرا | و شرح کامل اجزای سرم پروتئین
• راهنمای کامل الکتروفورز آگارز + تصویری | بیوتکنولوژی
• توضیح کامل تکنیک SDS-PAGE + رفع اشکال تکنیک الکتروفورز عمودی

کروماتوگرافی

 

کروماتوگرافی(به انگلیسی: Chromatography) یا سَوانِگاری روشی است در علم شیمی برای جداسازی اجزای یک مخلوط با عبور دادن یک فاز متحرک از روی یک فاز ساکن.

در این روش معمولاً مخلوط که به صورت مایع یا گاز است از یک لوله یا شبکه گذرانده می‌شود؛ سرعت حرکت اجزای تشکیل دهنده مخلوط در لوله یا شبکه مختلف است (با توجه به عناصر دیواره داخلی لوله یا شبکه) در نتیجه مخلوط به اجزای تشکیل دهنده تجزیه شده و هر جز جداگانه خارج می‌شود. در کروماتوگرافی دو فاز وجود دارد فاز ثابت و فاز متحرک، فاز ثابت در واقع اجزای درون لوله یا شبکه جداسازی را تشکیل می‌دهند و فاز متحرک مربوط به ماده‌ای است که می‌خواهد مورد تجزیه و تخلیص قرار بگیرد. فاز ثابت می‌تواند مایع یا جامد باشد که بر اساس اینکه جامد یا مایع باشد به کروماتوگرافی جذب سطحی و کروماتوگرافی تقسیمی، تقسیم می‌شوند. اساس جداسازی در کروماتوگرافی متفاوت می‌باشد جداسازی براساس وزن مولکولی و جداسازی بر اساس میل اتصال به فاز ثابت از اعم این اصول می‌باشد. کروماتوگرافی یک اصطلاح کلی است که در آزمایشگاه‌ها برای جداسازی ترکیبات استفاده می‌شود. این ترکیب در مایعی به نام فاز متحرک حل شده‌است و توسط ساختار دیگری به نام فاز ثابت نگه داری می‌شود. اجزای مختلف این ترکیب با سرعت‌های مختلفی حرکت می‌کنند و همین امر باعث جداسازی این ذرات می‌شود. جداسازی بر اساس تفکیک دیفرانسیلی بین فاز متحرک و ثابت انجام می‌شود. تفاوت‌های نامحسوس در مقدار پارتیشن یک ترکیب در فاز ثابت باعث جدایی اجزا می‌شود. کروماتوگرافی می‌تواند مقدماتی یا تحلیلی (تجزیه‌ای) باشد. هدف از کروماتوگرافی مقدماتی جداسازی اجزا برای استفاده‌های پیشرفته می‌باشد. این در حالی است که کروماتوگرافی تحلیلی به صورت نرمال بر روی گروه کوچکی از ۰مواد صورت می‌گیرد و برای اندازه‌گیری نسبت آنالیت‌ها در مخلوط می‌باشد. این دو با یکدیگر متناسب بوده و هیچ تضادی با یکدیگر ندارند.

تاریخچه

پر کاربردترین شیوه جداسازی مواد تجزیه‌ای کروماتوگرافی است که در تمام شاخه‌های علوم کاربردهایی دارد. کروماتوگرافی گروه گوناگون و مهمی از روش‌های جداسازی مواد را شامل می‌شود و امکان می‌دهد تا اجزای سازنده نزدیک به هم مخلوط‌های کمپلکس را جدا، منزوی و شناسایی کند بسیاری از این جداسازی‌ها به روش‌های دیگر ناممکن است. اولین روش‌های کروماتوگرافی در سال ۱۹۰۳ بوسیله میخائیل سوئت ابداع و نامگذاری شد. او از این روش برای جداسازی مواد رنگی استفاده کرد. مارتین و سینج در سال ۱۹۵۲ به پاس اکتشافاتشان در زمینه کروماتوگرافی جایزه نوبلدریافت کردند.

 

روش‌ها

روش‌های سوانگاری را می‌توان ابتدا بر حسب ماهیت فاز متحرک و سپس بر حسب ماهیت فاز ساکن طبقه‌بندی کرد. فاز متحرک ممکن است گاز یا مایع و فاز ساکن ممکن است جامد یا مایع باشد. بدین ترتیب فرایند کروماتوگرافی به چهار بخش اصلی تقسیم می‌شود. اگر فاز ساکن جامد باشد کروماتوگرافی را کروماتوگرافی جذب سطحی و اگر فاز ساکن، مایع باشد کروماتوگرافی را تقسیمی می‌نامند.

انواع کروماتوگرافی هر یک از چهار نوع اصلی کروماتوگرافی انواع مختلف دارد:

• کروماتوگرافی مایع – جامد

• کروماتوگرافی جذب سطحی

• کروماتوگرافی لایه نازک

• کروماتوگرافی تبادل یونی

• کروماتوگرافی ژلی

• کروماتوگرافی گاز – جامد

• کروماتوگرافی مایع – مایع

• کروماتوگرافی تقسیمی

• کروماتوگرافی کاغذی

• کروماتوگرافی گاز- مایع

• کروماتوگرافی گاز – مایع

• کروماتوگرافی ستون مویین

 

 

اصطلاحات کروماتوگرافی

• آنالیت ماده ای است که باید در طول فرآیند جدا شود. همچنین به طور معمول چیزی است که باید از مخلوط به دست آورد.
• کروماتوگرافی آنالیز کننده برای تعیین وجود و همچنین احتمالا غلظت آنالیت ( ها ) در یک نمونه استفاده می شود.
• فاز اتصالی یک فاز ساکن است که از با پیوند های از نوع کووالانسی به ذرات پشتیبان یا به درون دیواره ی ستون کروماتوگرافی متصل شده است.
• کروماتوگرام یک خروجی بصری از کروماتوگراف است.
• کروماتوگراف وسیله ی آزمایشگاهی است که امکان جدا سازی پیشرفته و تخصصی را فراهم می کند
• کروماتوگرافی یک روش فیزیکی جدا سازی است که اجزاء را برای جدا سازی بین دو فاز ، یک فاز ساکن و دیگری فاز
• elute  فاز متحرکی است که ستون را ترک می کند.
• eluent  حلالی است که آنالیت را با خود حمل می کند.
• eluotropic series  لیستی از حلال هایی است که بر اساس قدرت شویندگی شان رتبه بندی شده اند.
• فاز از حرکت ایستاده یک فاز ساکن است که بر روی اجزای حمایتی یا روی دیواره ی داخلی ستون کروماتوگرافی از حرکت ایستاده است.
• فاز متحرک فازی است که در یک جهت معین حرکت می کند ، می تواند مایع باشد ( LC و الکتروکروماتوگرافی مویی ( CEC )) ، یک گاز ( CG ) ، یا یک سیال فوق بحرانی ( کروماتوگرافی مایع – فوق بحرانی ، SFC ) باشد.
• کروماتوگرافی مهیا کنننده برای خالص سازی کمیت های کافی از مواد برای استفاده ی بیشتر ترجیحا تا آنالیز آن ها ، مورد استفاده قرار می گیرد.
• زمان بازداری زمانی است که برای یک آنالیت معین طول می کشد تا از میان سیستم ( از مسیر ستون به سمت آشکار ساز ) تحت شرایط مشخص عبور کند.
• نمونه ماده ی آنالیز شونده در فرآیند است. ممکن است از یک ترکیب تشکیل شده باشد یا مخلوطی از ترکیبات باشد.
• جسم حل شونده اشاره به ترکیبات نمونه در کروماتوگرافی تقسیمی دارد.
• حلال اشاره به هر ماده ای دارد که قادر به حل ماده ی دیگر باشد ، و به ویژه فاز متحرک مایه در کروماتوگرافی مایع را گویند.
• فاز ساکن ماده ی تثیبت شده در یک مکان برای عمل کروماتوگرافی است

آشکار ساز اشاره به ابزاری دارد که برای آشکار سازی کمی و کیفی آنالیت ها بعد از جدا سازی مورد استفاده قرار می گیرند.

 

 

کروماتوگرافی لایه نازک (TLC)

 

کروماتوگرافی لایه نازک نوعی کروماتوگرافی جذبی جامد – مایع است و اصول آن مانند کروماتوگرافی ستونی است. ولی در این مورد جسم جاذب جامد را به صورت یک لایه نازک در روی یک قطعه شیشه یا پلاستیک محکم پخش میکنند. یک قطره از محلول نمونه یا مجهول را در نزدیکی لبه صفحه میگذارند و صفحه را همراه مقدار کافی از حلال استخراج کننده در ظرفی قرار میدهند. مقدار حلال باید آنقدر باشد که فقط به سطح زیر لکه برسد (شکل الف). حلال به طرف بالای صفحه میرود و اجزاء مخلوط را با سرعتهای متفاوت با خود میبرد. در نتیجه ممکن است تعدادی لکه روی صفحه ظاهر شود. این لکه ها روی یک خط عمود بر سطح حلال ظرف قرار میگیرند (شکل ب).

 

 

این روش کروماتوگرافی بسیار آسان است و به سرعت هم انجام میشود. این روش برای تفکیک اجزاء یک مخلوط بسیار مفید است و همچنینی میتوان از آن برای تعیین بهترین حلال استخراج کننده جهت کروماتوگرافی ستونی استفاده کرد.

در TLC میتوان از همان مواد جامد که در کروماتوگرافی  ستونی استفاده میشود استفاده کرد و در این میان سیلیکا و آلومینا بیشتر به کار میرود. معمولا جسم جاذب را با مقدار کمی از ماده نگهدارنده مانند گچ شکسته بندی، کلسیم سولفات و یا نشاسته مخلوط میکنند تا جسم جاذب چسبندگی لازم را پیدا کند و به صفحه بچسبد. صفحه ها را میتوان قبل از مصرف تهیه کرد و یا از ورقه های پلاستیکی آماده که در بازار موجود است استفاده نمود.

یکی از مزایای مشخص TLC آن است که احتیاج به مقدار بسیار کمی از نمونه دارد. در بعضی موار میتوان تا مقدار ^9-10 گرم را تشخیص داد. اما ممکن است اندازه نمونه تا 500 میکرو گرم برسد. در نمونه های زیاد میتوان از تجربه های تهیه ای استفاده کرد. در این تجربه ها لکه های مختلف را میتراشند و با یک حلال مناسب میشویند (استخراج میکنند). و برای شناسایی (از طریق طیف سنجی) به کار میبرند.

تشخیص لکه های رنگین در روی کروماتوگرام آسان است و برای تعیین محل لکه های اجسام بیرنگ روشهای متعددی وجود دارد. برای مثال میتوان با تابش نور ماوراء بنفش به صفحه محل لکه، ترکیبهایی را که خاصیت فلوئورسانس دارند مشخص کرد. به روش دیگر میتوان جسم جاذب را با ماده فلوئورسانس دار بی اثر دیگری مخلوط کرد. هنگامی که نور ماوراء بنفش به این صفحه بتابد، لکه اجسامی که نور ماورای بنفش را جذب می کنند ولی خاصیت فلوئورسانس ندارند در زمینه فلورسانس دار صفحه به صورت تیره رنگ ظاهر میشوند. در بسیاری موارد دیگر، از معرفهای آشکارساز دیگری استفاده میکنند. این معرفها را میتوان بر روی کروماتوگرام پاشید و لکه ها را ظاهر کرد. سولفوریک اسید، که بسیاری از ترکیبات آلی را به ذغال تبدیل میکند و محلول پتاسیم پرمنگنات نمونه هایی از معرفهای آشکار ساز هستند که به این روش مصرف میشوند. ید نیز معرف آشکار ساز دیگری است که مصرف میشود. در این مورد صفحه را دز ظرفی میگذارند که محیط آن از بخار ید اشباع باشد. بسیاری از ترکیبات آلی ید را جذب میکنند و لکه آنها روی کروماتوگرام رنگین (معمولا قهوه ای) میشود.

در شرایط معین سرعت حرکت ترکیب نسبت به سرعت پیشرفت حلال (R_f) خاصیت مشخصی از ترکیب است. برای تعیین این مقدار مسافتی را که جسم از خط شروع تا وسط لکه را طی کرده است اندازه میگیرند و آنرا به مسافتی که حلال پیموده تقسیم میکنند. این مسافت را با خط شروع یکسانی میسنجند.

 

 

 

مقایسه کروماتوگرافی لایه نازک با انواع کروماتوگرافی

مقایسه با کروماتوگرافی ستونی جذب سطحی:

کروماتوگرافی ستونی جذب سطحی متداول ، فرآیندی کند است و مقادیر نسبتا زیادی از جاذب و نمونه لازم دارد. پیشرفت‌های اخیر در سیستم‌های با کارایی بالا مطمئنا مشکلات سرعت ، مقیاس و شناسایی را از بین برده‌اند. ولی این سیستم‌ها قیمت خیلی زیادی دارند و دستگاه مربوط به آنها بسیار پیچیده است. در کروماتوگرافی لایه نازک تنها مقادیر کمی از جاذب و نمونه لازم است، دستگاه ساده و ارزان است.
لکه‌های جدا شده در روی صفحه مانند کروماتوگرافی کاغذی آشکار می‌شوند بنابراین ، معمولا جمع‌آوری اجزا لازم نیست. با وجود این هیچ اشکالی در انجام جدا سازی‌های مقدماتی وجود نداشته و جداسازی مواد با افزایش ضخامت لایه و یا به کار بردن مقدار زیادی از نمونه ، بیشتر انجام می‌گیرد. بعد از جداسازی مواد ، به دست آوردن یک جسم بطور مجزا به طریق فراشیدن و جمع ‌آوری آن قسمت از لایه که جسم بر روی آن جذب شده ، ساده است. بعد از این عمل می‌توان جسم را در یک حلال مناسب استخراج کرد.

مقایسه با کروماتوگرافی کاغذی :

روش لایه نازک دارای مزیت عمده سرعت بیشتر ، در اکثر موارد ، جداسازی مواد بهتر می‌باشد. زمان متوسط برای حرکت حلال به مقدار ۱۰ در کروماتوگرافی لایه نازک روی سیلیکاژل ۳۰ – ۲۰ دقیقه است، در صورتی که همان جداسازی مواد بر روی یک کاغذ سریع ممکن است ۲ ساعت طول بکشد. جداسازی مواد بهتر به این واقعیت مربوط می‌شود که جاذب در کروماتوگرافی لایه نازک دارای ظرفیت بیشتری نسبت به کاغذ در کروماتوگرافی کاغذی است. بنابراین لکه‌های جدا شده شکل و اندازه کله اصلی را به طور نسبتا زیادی حفظ می‌کنند و پخش شدن وابسته به کروماتوگرافی تقسیمی روی کاغذ در لایه نازک صورت نمی‌گیرد.

 

كروماتوگرافي ستوني

 

در كروماتوگرافي ستوني جسم بين فازهاي مايع و جامد پخش ميشود. فاز ساكن جسم جامدي است و اين جسم اجزاي مايعي را كه از آن ميگذرد به طور انتخابي در سطح خود جذب ميكند و آنها را جدا ميكند. اثرهايي كه باعث جذب سطحي ميشوند همان اثرهايي هستند كه موجب جذب در مولكولها ميشوند. اين اثرها عبارتند از: جاذبه الكترواستاتيكي، ايجاد كمپلكس، پيوند هيدروژني، نيروي واندروالس و غيره.

براي جدا كردن يك مخلوط با كروماتوگرافي ستوني، ستون را با جسم جامد فعالي (فاز ساكن) مانند آلومينا يا سيليكاژل پر ميكنند و كمي از نمونه مايع را روي آن ميگذارند. نمونه ابتدا در بالاي ستون جذب ميشود. سپس حلال استخراج كننده اي را در داخل ستون جريان ميدهند. اين فاز مايع متحرك، اجزاي مخلوط را با خود ميبرد. ولي به علت نيروي جاذبه انتخابي فاز جامد، اجزاي مربوط ميتوانند با سرعتهاي مختلفي به طرف پايين ستون حركت كنند. تركيبي كه با نيروي كمتري جذب فاز ساكن شود سريعتر خارج ميشود زيرا كه درصد مولكولي آن در فاز متحرك از تركيبي كه با نيروي زيادتري جذب فاز ساكن ميشود بيشتر است.

اجزاي تفكيك شده را ميتوان مجددا به دو روش به دست آورد:

1) مواد جامد ستون را ميتوان خارج كرد و قسمتي از آنرا كه حاوي باند مورد نظر است بريد و با حلال مناسب استخراج كرد.

2) چون باندها با زمانهاي مختلفي خارج ميشوند ميتوان آنقدر حلال را از ستون عبور داد تا باندها از انتهاي آن خارج شوند و در ظرف جداگانه اي بريزند.

معمولا روش دوم كاربرد بيشتري دارد.

در مورد اجسام رنگين ميتوان باندهايي را كه به طرف پايين ستون مي آيند مستقيما مشاهده كرد.

 

 اما در مورد اجسام بيرنگ نميتوان تغييرات را مستقيما مشاهده كرد. با اين حال بسياري از اجسام در هنگام تابش نور ماوراي بنفش فلوئورسانس پيدا ميكنند و در چنين مواردي از اين خاصيت جهت مشاهده باندها استفاده ميشود. معمولا براي پي بردن به جريان عمل كروماتوگرافي ستوني حجمهاي كوچك و ثابتي (مثلا 25 ميلي ليتر) از محلول استخراج شده را جمع آوري ميكنند. سپس حلال آنها را تبخير ميكنند تا ببينند جسمي در آنها وجود دارد يا خير. گرچه ممكن است يك جسم در چند ظرف پخش شود، ولي اگر حجم هر جزء نسبتا كم گرفته شود (مثلا كمتر از 10% حجم ستون) معمولا باندهاي مختلف در ظروف مختلف جمع آوري ميشوند. روش ديگري كه براي پي بردن به وضع تفكيك مناسب است آن است كه محلول استخراج شده در فاصله زماني مختلف با كروماتوگرافي لايه نازك مورد بررسي قرار گيرد.

تعدادي از جاذبهاي جامدي كه عموما مصرف ميشوند عبارتند از: آلومينا، سيليكاژل، فلورسين، زغال چوب، منيزيم اكسيد، كلسيم كربنات، نشاسته و شكر. معمولا شيميدانهاي آلي از آلومينا، سيليكاژل و فلورسين بيشتر استفاده ميكنند.

آلومينا (Al₂O₃) تركيب قطبي بسيار فعالي است كه قدرت جذب زيادي دارد و به سه صورت موجود است: خنثي، شسته شده با اسيد و شسته شده با باز. آلوميناي بازي براي تركيبهاي اسيدي و آلوميناي اسيدي براي تركيبهاي بازي قدرت تفكيك خوبي نشان ميدهد. در تركيبهايي كه به شرايط اسيدي و بازي حساسيت دارند و واكنش شيميايي دارند بايد از آلوميناي خنثي استفاده كرد. آلومينا با قطبيت زيادي كه دارد تركيبهاي قطبي را به شدت جذب ميكند و در نتيجه ممكن است استخراج آنها از ستون را مشكل كند. فعاليت (قدرت جذب) آلومينا را ميتوان با افزايش كمي آب كاهش داد، درجه فعاليت آلومينا با درصد وزني آب موجود مشخص ميشود. سيليكاژل و فلورسين هم قطبي هستند ولي قطبيت آنها از آلومينا كمتر است.

براي اينكه جاذبهاي جامد نيروي موثر تري داشته باشند، بايد اندازه ذرات آنها يكنواخت و سطح مخصوص آنها زياد باشد. چنين سطحي باعث تسريع تعادل جسم در دو فاز ميشود. اين حالت در ايجاد باندهاي باريك اهميت دارد.

در تعيين شرايط يك تجربه كروماتوگرافي بايد به ماهيت فاز مايع (حلال) مصرفي توجه كرد. حلال نيز ميتواند در جسم جامد جذب شود و به اين وسيله براي جذب مواضع جذبي كه در سطح جامد وجود دارند، با جسم حل شده رقابت كند. چنانچه حلال قطبي تر باشد و شديدتر از اجزاي مخلوط جذب شود، تقريبا تمام اجزاء در فاز مايع متحرك باقي ميمانند و تفكيكي كه در ضمن تجربه صورت ميگيرد ناچيز خواهد بود. در نتيجه براي اين كه تفكيك خوب انجام شود بايد قطبيت حلال استخراجي به طور قابل ملاحظه اي كمتر از اجزاي مخلوط باشد. به علاوه بايد اجزاي مخلوط در حلال حل شوند، زيرا در غير اين صورت اجزا به طور دايم در فاز ساكن ستون جذب ميشوند و در آن باقي ميمانند. قدرت استخراجي حلالهاي مختلف (يعني توانايي آنها در انتقال يك جسم معين به پايين ستون) بترتيب زير از بالا به پايين زياد ميشود:

هگزان

كربن تترا كلريد

تولوئن

بنزن

دي كلرومتان

كلروفرم

اتيل اتر

اتيل استات

استون

پروپانول

اتانول

متانول

آب

در يك كروماتوگرافي ستوني ساده نمونه را در بالاي ستون ميگذارند و در طول تفكيك از حلال واحدي استفاده ميكنند. بهترين حلال انتخابي، حلالي است كه بيشترين فاصله را در باندها ايجاد كند. چون احتمالا بهترين حلال در اثر تجربه بدست مي آيد، گاهي راحتتر است كه در انتخاب حلال براي كروماتوگرافي ستوني از روش كروماتوگرافي لايه نازك استفاده شود. تعداد زيادي از تجربه هاي كروماتوگرافي لايه نازك را ميتوان با استفاده از حلالهاي مختلف، در زمان نسبتا كوتاهي انجام داد. معمولا بهترين حلال يا مخلوط حلالي كه به اين روش به دست مي آيد براي كروماتوگرافي ستوني مناسب است.

معمولا از روشي كه به استخراج تدريجي (يا جزء به جزء) معروف است استفاده ميشود. در اين روش براي ظهور كروماتوگرام از يك سري حلالهايي استفاده ميكنند كه قطبيت آنها مرتبا رو به افزايش ميرود. در شروع با يك حلال غير قطبي (معمولا هگزان) ممكن است يك باند به طرف پايين ستون حركت كند و از آن خارج شود و در اين حال باندهاي ديگر در نزديكي ابتداي ستون باقي بمانند. سپس حلالي كه قطبيت آن اندكي بيشتر است به كار ميبرند. در حالت ايده آل بايد يك باند ديگر خارج شود و در اين حال بقيه باندها در عقب آن باقي بمانند. چنانچه قطبيت حلال يكباره زياد بالا رود، ممكن است تمام باندهايي كه باقي مانده اند يكباره از ستون خارج شوند. بنابر اين بايد در هر مرحله قطبيت حلال به مقدار كم و با قاعده معيني افزايش يابد. بهترين راه انجام اين كار آن است كه از حلالهاي مخلوط استفاده شود و تعويض كامل حلال چندان مناسب نسيت.

طريقه پر كردن ستون بسيار اهميت دارد زيرا ستوني كه خوب پر نشود اجزاء را هم خوب تفكيك نميكند. جسم پرشده بايد همگن باشد و در آن هواي محبوس يا حباب بخار وجود نداشته باشد. 

 

آماده سازي ستون كروماتوگرافي

 

يك بورت 50 ميلي ليتري را در حالت عمودي به گيره اي ببنديد. شير بورت بايد بسته و چرب نشده باشد. بورت را با اتر نفت (60-30 درجه ) تا نزديكي درجه 40 ميلي ليتري آن پر كنيد و به كمك يك لوله شيشه اي طويل كمي پشم شيشه را به انتهاي بورت فرو بريد. درون بروت به حدي شن بريزيد تا ارتفاع 1 سانتي متري بالاي پشم شيشه را بپوشاند. پس از خروج كامل حبابهاي درون شن، در حالي كه به آرامي به ديواره بورت ضربه ميزنيد 15 گرم آلومينا را به داخل لوله بريزيد. هنگام پايين رفتن آلومينا ستون را تكان دهيد. اين اعمال به پر شدن يكنواخت ستون كمك ميكنند. جدار داخلي بورت را كه آلومينا به آن چسبيده با اتر نفت اضافي بشوييد. براي محافظت از آلوميناي پر شده يك لايه 1 سانتي متري شن در بالاي ستون قرار دهيد. شير بورت را باز كنيد و بگذاريد تا حلال خارج شود و درست به بالاي لايه شن بالايي برسد. حال ستون براي قرار دادن نمونه مخلوط مورد تفكيك آماده است.

 

 

«کروماتوگرافی مايع با فشار زياد HPLC »

 

مي دانيم كه كروماتوگرافی روشي است براي شناسائي و جدا سازی و اندازه گيري مواد است. HPLC يعني كروماتوگرافي مايع با فشار زياد يا كروماتوگرافی مايع با كاركرد عالي است. HPLC از دو فاز ثابت و متحرك تشكيل شده است. كه فاز ثابت ممكن است جامد و يا مايع باشد و فاز متحرك مايع است.  

 

اجزاء و قسمتهاي مختلف دستگاه HPLC

 

1- مخازن حلال: كه در آنها فاز متحرك و يا حلالهاي شستشو دهنده ستون ريخته شده است.

2- موتور يا پمپ: چون ستونها نسبتا طويل و اندازه ذرات كم است. به اين جهت قابليت نفوذ كم مي شود و براي اين كه حلال جريان داشته باشد بايد فشاروجود داشته باشد. براي ايجاد فشار از پمپ يا موتور استفاده مي كنيم. پمپ فشاري حدود psi 4500 مي تواند ايجاد كند. و بايد بتواند فشار ثابت ايجاد كند. حلال توسط پمپ با فلوي ثابتي بر روي فاز ثابت حركت داده مي شود. حداكثر فلوئي كه فاز متحرك مي تواند داشته باشد ml/min 2.5 است. و بسته به نوع كاري كه مي خواهيم انجام دهيم فلو فرق مي كند، هر چه فلو كمتر باشد، فاصله ي پيك ها بيشتر است. چهارمخزن داريم مخزنD, C, B, A ميزان فشار بستگي به فلوي ما دارد وقتي فلو ml/min 0.8 است ميزان فشار حدود psi 1500 مي شود. ميزان فشار بستگي به نوع ستون دارد حداكثر فشار مجاز Psi 3500 است. حداكثر تغييرات فشار Psi 100 است. حداكثر فلوريت Flow rate ، ml/min 2.5 است. پس پمپ، حلال را از مخزن مي گيرد و با سرعت گذر ثابتي آن را بداخل دستگاه وارد مي كند. در دماي آزمايشگاه كار مي كنيم.

 به دو روش مي توانيم كار كنيم:

• روش ايزوكراتيك isocratic: اگر نسبت هاي مختلفی از فاز متحرك را در يك مخزن بريزيم و از همان مخزن فاز متحرك را برداشت كنيم از روش ايزوكراتيك استفاده كرده ايم. مثلا در کار عملی انجام شده درآزمایشگاه فاز متحرك( 80% بافر فسفات 12%  متانل و 8% استونيتريل) است كه پس از صاف كردن همه را در يك مخزن مثل D مي ريزيم و از همان مخزن پمپ برداشت  مي كند.

2- روش گراديانت gradient :اجزاء فاز متحرك در مخازن مختلف ريخته مي شود. دستگاه قابليت اين را دارد كه خودش نسبت هاي مختلف را از مخازن برداشت كند (طبق داده هاي ما)، مثلا می خواهيم ازمخزن A، 80% از مخزن B 8% و از مخزن C 12% بكشد. و بعد نسبت ها را مخلوط مي كند. از اين روش وقتي استفاده مي كنيم كه نسبت هاي موردنظر را نمی دانيم و بخواهيم روش کارپيدا كنيم. ولي وقتي درصد فاز متحرك براي ما روشن شد مي توانيم از روش ايزوكراتيك استفاده كنيم. فاز متحرك با فلوي ثابتي بر روي ستون حركت داده مي شود حداكثر فلو در این آزمایش ml/min0.8 يا 1 است. بعد از فعال كردن هر پمپ flow rate را از كم به زياد كم كم بالا مي بريم تا حدود ml/min  0.8 يا 1 و مي گذاريم حدود يك ربع ساعت يا نيم ساعت با فلوريت بالا كار كند و بعد فلوريت را به تدريج پايين مي آوريم تا صفر و بعد پمپ را عوض مي كنيم. يا دستگاه را خاموش مي كنيم، فلوريت كه بالا برود فشار هم بالا مي رود. بعد از اتمام كار ستون را با حلالهاي شستشو دهنده مي شوئيم.  حلالهاي شستشو را در مخازن ريخته و پمپ ها را به ترتيب فعال مي كنيم اول دستگاه را با آب و متانل شسته و سپس با متانل خالص مي شوئيم. هر پمپ را كه فعال كرديم بايد ابتداهوا گیری کنیم.

تهيه بافرفسفات: 13.6 گرم از Po4H2K را وزن كرده (0.1M) و به حجم يك ليتر مي رسانيم pH ، 4.5 مي شود كه با اسيد فسفريك غليظ حدود يك دو قطره pH را به حدود 3.5 مي رسانيم.

3- injector: از سرنگهاي مختلف با ظرفيت هاي مختلف استفاده مي كنيم. حجم تزريق 30 ميكروليتر است. نمونه ابتدا وارد قسمتي بنام گارد كالوم يا پري كالوم مي شود كه محافظ ستون است، طول كاردكالوم حدو يك سانتي متر است. و جنس آن از فولاد ضد زنگ است، و ماده پركننده آن از جنس ماده پركننده ستون است. اگر ماده ما ناخالصي داشته باشد يا با ماده داخل ستون واكنش ايجاد كند درگاردكالوم انجام مي شود و به ستون آسيبي نمي رسد.

4- ستون: طول ستونهاي دستگاه حدود 30-10 سانتي متر است. و جنس آن از فولاد ضدزنگ است. پرمصرف ترين ستون C₁₈ ، ODS آکتا دسيل سيلان است، ستونها را پس از اتمام كار بايد با محلولهاي شستشو دهنده شست. اگر از بافرفسفات استفاده كرديم ستون را با آب و متانل و بعد با متانل خالص شستشو مي دهيم. فاز ثابت بصورت ذرات ريزي در داخل ستون قرار گرفته است. كه بر اثر چسبيدن و پخش شدن اجزاء نمونه و عبور فاز متحرك جداسازي انجام مي شود. نمونه ابتدا وارد گاردكالوم و بعد وارد ستون مي شود، گارد كالوم را پس از مدتي بايد عوض كرد، ODS اكتا دسيل سيلان گروههاي الكيل غيرقطبي زيادي دارد، فاز متحركي كه استفاده مي كنيم قطبي است. فاز متحرك و ماده پركننده ستون از نظر قطبيت بايد عكس هم باشند. در HPLC امکان استفاده از فاز نرمال و معكوس هست. اگر فاز ثابت قطبي و فاز متحرك غيرقطبي باشد سيستم را فاز نرمال و در صورتي كه ستون غيرقطبي و حلال قطبي باشد. سيستم را فاز معكوس مي گويند. مشتقات آلكيل سيلان و فنيل سيلان ايجاد ستونهاي غير قطبي مي كنند و معمولا ستون غير قطبي و فاز متحرك قطبي است بنابراين از فاز معكوس استفاده می شود. جنس ستونها از فولاد ضدزنگ يا Stainless steel است.

5- رديابها: رديابها بايد حساس باشند و اثر مخرب بر روي اجسام نداشته باشند. پاسخ آنها تا حدود وسيعي براي غلظت بايد خطي باشد. انواع رد یاب ها: (a )- مهمترين آنها ردياب ماورا بنفش است که براي اجسامي كه در ناحيه UV-VIS جذب داشته باشند مورد استفاده قرار می گیرد. در اين دتكتور جذب انجام مي شود و باعث كاسته شدن انرژي مي شود كه اين كاسته شدن قابل اندازه گيري است. ميزان كاسته شدن انرژي متناسب است با غلظت، بايد طول موج را مشخص كنيم كه در اينجاnm  l=225 است. حلال نبايد در طول موج انتخابي جذب داشته باشد..

 .bردياب ضريب شكست، اين ردياب خيلي حساس به حرارت است.از تغييرات يا تفاوتي كه بين ضريب شكست سيستم حلال به تنهايي و سيستم حلال همراه نمونه ايجاد مي شود استفاده مي كنيم.

1. c. دتكتور فلورسانس حساس تر از UV است ولي كم مصرف مي باشد چون موادي كه خاصيت فلورسانس داشته باشند كم هستند.

 . dردياب الكتروشيميايي كه عملکرد آن بر مبنای واکنش های اکسید و احیا می باشد.

6- ثبات (ركوردر): در اثر حركات قلم پيك هائي رسم مي شود كه به  مجموعه آنها كروماتوگرام مي گويند.به طريق كيفي پيك ها را براساس زمان باز داري يا نگهداري يا Retention time مي شناسند. زمان بازداري فاصله زماني از لحظه تزريق تا رسيدن به نقطه اوج يك پيك است. براي محاسبه كمي سطح هر نوار جذبي را حساب مي كنيم، سطح هر نوار جذبي متناسب با مقدار جسم است كه بوسيله انتگراتور يا سطح سنج با دستگاه ثبات بدست مي آيد سطح هر نوار جذبي يعني حاصلضرب قاعده × نصف ارتفاع است. روش بريدن نوار و وزن كردن آنها روش قديمي است. ولي امروزه توسط سطح سنج يا انتگراتور بدست مي آيد خود دستگاه AUC را مشخص مي كند. مي توان از ارتفاع هم استفاده كرد و نسبت ارتفاع ها را مشخص كنيم AUC و ارتفاع با يك دستور ساده قابل تبديل بهم هستند. روش رسم منحني را انجام مي دهيم. در محور افقي غلظت ها و در محور عمودي AUC . بعد از رسم منحني استاندارد، غلظت مجهول را از روي رسم منحني بدست مي آوريم.

 

  

«گاز کروماتوگرافی  GC»

 

 GC براي شناسايي و تعيين مقدار انجام مي شود. در GC با دو فاز سر و كار داريم: فاز ساكن و فاز متحرك، فاز متحرك يك گاز است و فاز ساكن مي تواند مايع يا جامد باشد. فاز متحرك هيچ نقشي در جداسازي ندارد و يكي از تفاوت هاي GC با HPLC همين موضوع است. در HPLC فاز متحرك يك مايع است كه در جداسازي نقش دارد. تنها نقش فاز متحرك در GC حمل مواد به جلو و خارج كردن آنها از ستون است. به همين دليل كيفيت جداسازي در HPLC بهتر است از GC.

ابتدا نمونه را توسط سرنگ داخل injector تزريق مي كنيم. نمونه پس از ورود به injector به بخار تبديل شده و با فاز متحرك مخلوط شده، وارد ستون مي شود. نمونه جذب ستون مي شود و در زمانهاي مختلف به وسيله گاز بي اثر از ستون بيرون مي آيد و وارد دتكتور مي شود. ستون قلب دستگاه است زيرا عمل اصلي كه جداسازي است در آنجا انجام مي شود. دتكتور شناسايي را انجام مي دهد جهت شناسايي مواد با GC از (R_t) Retention time  استفاده مي شود. R_t زماني است كه طول مي كشد تا جسم از دتكتور بيرون بيايد ،يعني از زمان تزريق نمونه تا زمان ظاهرشدن پيك ها روي دستگاه كه براي يك ماده تحت شرايط ثابت، مقداري ثابت است. بنابراين از مقايسه R_t معلوم با R_t مجهول، مي توان اجزاي موجود در مجهول را تشخيص داد.

 اگر مجهول و استاندارد، R_t يكسان داشتند، مي توان نتيجه گرفت كه هر دو نمونه يكي هستند.

پارامتر مهم ديگر در GC، سطح زير منحني (AUC) است. ركوردر به ما كروماتوگرامي مي دهد كه در راس هر پيك R_t  را مي نويسد و AUC مربوط به آن را هم مي دهد پس كروماتوگرام حاوي دو اطلاع ارزنده است:

1- R_t براي شناسايي كيفي جسم

2- AUC براي تعيين مقدار كمي جسم

گاز حامل: يك گاز بي اثر است (He, H₂, N₂)، He از همه بهتر است ولي چون گران است كاربرد كمي دارد. نگهداري H₂ هم خطرناك است چون قابليت انفجار دارد، بنابراين N₂ استفاده مي شود.

 

اجزاء و قسمتهاي مختلف دستگاه GC 

 

1- سليندر حاوي گاز حامل، در اين دستگاه از گاز ازت كه گازي خنثي، ارزان و در دسترس است استفاده مي شود.

2- فلومتر، توسط اين قسمت از دستگاه تنظيم فشار گاز حامل صورت مي گيرد كه اگر نمونه سريعتر بيرون بيايد ممكن است دو پيك روي هم بيفتند. هر چه فلو بيشتر باشد، مواد سريعتر از ستون خارج مي شوند. . فلو برحسب ml/min است. (در كار با GC بايد نوع گاز حامل و flue آن ذكر شود).در اين دستگاه از گاز ازت با فلو ml/min 18 استفاده شد.در اين دستگاه سه عدد فلومتر مربوط به تنظيم فلو گاز ازت، هوا و هيدروژن وجود داشت. كه هر كدام را با ميزان موردنياز تنظيم كرديم

3- محل تزريق نمونه :(injector)دو محل تزريق در بالا و پائين وجود دارد كه نمونه را به سرعت و توسط يك سرنگ در يكي از آنها بسته به اينكه از ستون بالايي يا پاييني استفاده مي كنيم تزريق مي كنيم. حجم نمونه تزريق شده در اين آزمايش يك ميكروليتر بود. اما حجم سرنگ دستگاه ده ميكروليتر است. .با GC مي توان نمونه هاي با حجم هاي بسيار كم تا دهم هاي ميكروليتر را اندازه گيري نمود. بعد از تزريق نمونه به سرعت و بدون مكث دكمه interface را فشار مي دهيم. (حجم تزريق هم بايد در كار با GC گزارش شود).

4- ستون (column):ستون نقش اصلي جداسازي را به عهده دارد كه از جنس هاي مختلف مي باشد:ستون فولادي،مسی ،شيشه ايی يا استيل باشد .كه سخت پر مي شود و حتما بايد توسط كارخانه سازنده پر شود.

ستون مسي: انعطاف پذيري خوبي دارد و به راحتي پر مي شود زيرا مي توان آن را به صورت مستقيم پر كرد و سپس به صورت مارپيچ در آورد. ولي عيب آنها تشكيل اكسيد مس در جداره ستون مي باشد كه مي تواند برخي واكنش ها را كاتاليز كند. در حالي كه ستون هاي فولادي اين عيب را ندارند.

ستون هاي شيشه اي كه مزيت آنها اين است كه داخل آنها را مي توانيم مشاهده كنيم بنابراين اگر هوا گرفته باشد متوجه مي شويم و عيب آنها شكننده بودنشان است. ستون هاي فولادي خيلي مستحكمند و بايد در كارخانه بصورت مارپيچ در آيند، بنابراين پركردن آنها مشكل است و احتياج به دستگاه ويبراتور داريم. يك ويژگي مهم و تاثير گذار در ستون ها پلاريته آنهاست كه توسط كارخانه سازنده مشخص مي شود كه بر اين اساس مي توان ستون هاي مشابه را انتخاب كرد.

. ما در اين آزمايشگاه از ستون Capillary استفاده مي كنيم با طول حدود m 30، نوع ستون PE-1 است. N2 گاز ® فاز متحرك

GSC جامد      فاز ثابت

GLC مايع

براي فاز مايع از خاكه آجر يا chromosorb p كه بي اثر است براي تثبيت مايع استفاده مي كنند آن را پر مي كنند. و مايع ديرجوش را روي خاكه آجر مي دهند و تثبيت مي كند كه معمولا پارافين يا silicon greas است.

5- Oven:قسمت گرم كننده است.سه قسمت از دستگاه بايد گرم شوند. Injector, oven و Column (كه دو عدد هستند و در بالا و پايين oven قرار مي گيرند) و نيز Detector قرار دارد

 دماي ستون بايد چند درجه بالاتر از نقطه جوش دير جوش ترين جزء موجود در نمونه باشد مثلا اگر بالاترين نقطه جوش °C 150 باشد، دماي ستون °C 170 باشد.دماي injector بايد چند درجه بالاتر از ستون و دماي دتكتور هم چند درجه بالاتر از injector باشد با ستون با دو برنامه دمايي مي توان كار كرد:اگر روش كار ايزوترمال باشد به oven يك دماي ثابت مي دهيم اما اگر به روش برنامه ريزي كار كنيم، بايد به آن برنامه دمايي بدهيم.

روش Isothermal ( با يك دماي ثابت كار مي كنيم)، بيشتر زماني استفاده مي شود كه در نمونه فقط يك ماده مورد شناسايي وجود دارد يا اگر چند ماده وجود دارد، نقطه جوش آنها نزديك به هم است.

روش برنامه ريزي دمايي (programming): در مواقعي استفاده مي شود كه مواد موجود در نمونه Range وسيعي از نقطه جوش دارند و اگر ابتدا دماي Oven را بالاتر از نقطه جوش دير جوش ترين ماده قرار دهيم، مواد با نقطه جوش كمتر تجزيه خواهد شد و نمي توان آنها را شناسايي كرد. بنابراين طوري دما را تنظيم مي كنيم كه با سرعت مشخصي از چند درجه بالاتر ازمواد به ترتيب نقطه جوش از ستون بيرون مي آيند يعني هر چه تعداد كربن هاي ماده بيشتر باشد ديرتر بيرون مي آيند و پيك آنها ديرتر ظاهر مي شود. وقتي نمونه اي حاوي چند جزء با طيف وسيع BP است نمي توان از روش ايزوترمال استفاده كرد زيرا با داشتن فقط يك دما، ممكن است يك جزء خيلي سريع بيرون بيايد و از دست برود يا بيرون آمدن آن، زمان طولاني ببرد. بنابراين بايد از روش Programming استفاده كنيم، يعني از چند Oven استفاده كرده و به هر يك، دمايي خاص مي دهيم.در دستگاه ،3، Oven داريم كه از تعداد موردنياز بسته به كاربرد مي توان استفاده كرد. هر Oven مثل يك ايستگاه مي باشد كه در هر يك، ماده زماني متوقف مي باشد و سپس با Rate خاصي از هر ايستگاه به ايستگاه ديگر مي رود. پس در صورت استفاده از هر 3 Oven، 2 Rate مي گيريم:درجه حرارت داده شده به Oven ها تجربي است و مثلا روي دمايي خاص گذاشته و بررسي مي كنيم كه پيك مي گيريم يا نه ؟

اگر پيك در نمونه بهم چسبيده باشد، با كم كردن درجه حرارت Oven و فلوي گاز، پيك ها را جدا مي كنيم.اگر فقط از 2 Oven استفاده مي كرديم بايد Time₃=0 ، Rate₂=0 مي بود، در واقع به 3 Oven  برنامه نمي دهيم. Rate   بين 5-30 des/min مي تواند باشد.

نقطه جوش زود جوش ترين ماده به چند درجه بالاتر از نقطه جوش دير جوش ترين ماده برسد به اين ترتيب مي توانيم تمام مواد موجود در نمونه را شناسايي كنيم و كيفيت كار ما بالا مي رود.

6-  :Detectorدتكتور بر اساس پاسخي كه مي دهد به دو دسته تقسيم مي شود:

دتكتور انتگرالي، كه پاسخ انتگرالي مي دهد. كه امروزه منسوخ شده است.

دتكتور تفكيكي، پاسخ اين دتكتور به اين صورت است كه وقتي گاز حامل به تنهايي مي آيد، خط صاف و وقتي به همراه نمونه مي آيد يك پيك مي دهد.

يكي از دتكتورهاي تفكيكي كه در GC استفاده مي شود Flame Ionization Detector (FID) مي باشد. نمونه ها بعد از اينكه از ستون خارج مي شوند وارد دتكتور مي شوند. نمونه ها در شعله دتكتور مي سوزند و ايجاد يون و الكترون مي كنند. آنچه مهم است الكترون هايي است كه توليد مي شوند. الكترونها جرياني را كه از FID عبور مي كند افزايش مي دهند و غلظت نمونه متناسب با ­ ميزان جريان است .

براي تشكيل شعله از سوخت هيدروژن با اكسيژن هوا استفاده مي كنيم. چون نگهداري هيدروژن خطرناك است و امكان انفجار وجود دارد، يك هيدروژن ژنراتور وجود دارد كه از تجزيه آب هيدروژن توليد مي كند. براي تامين اكسيژن هم از كپسول هوا استفاده مي شود.

نشانه روشن بودن دستگاه دتكتور اين است كه بخار آب از آن خارج شود. FID حساسيت بالايي دارد و عيب آن تخريب نمونه است در اين دستگاه از FID استفاده كرديم. (نوع دتكتور هم بايد در كار تحقيقاتي ذكر شود).

  7- رکوردر

چگونگي تنظيم دما:

دماي ستون را چند درجه بالاتر از نقطه جوش دير جوشترين جزء موجود در نمونه قرار مي دهيم و دماي injector را چند درجه بالاتر از ستون و نيز دماي دتكتور نيز چند درجه بالاتر از دماي injector قرار مي دهيم.

برنامه دمايي ايزوترمال:

70°C = oven ستون

90°C = Injector

mLit = مقدار تزريق    100°C= Detector

علت استفاده از استاندارد داخلي:

در روش AUC بايد از استاندارد داخلي استفاده كنيم كه علت استفاده از استاندارد داخلي، حذف خطاي حاصل از حجم تزريق مي باشد. زيرا حجم تزريق كم است و احتمال اشتباه زياد مي باشد و براي استفاده كمي و حذف اين خطا از يك استاندارد داخلي كه از لحاظ ساختمان شيميايي نزديك به نمونه باشد استفاده مي كنيم مثلا در اين آزمايش براي تعيين مقدار اتانول از بوتانول به عنوان استاندارد داخلي استفاده مي كنيم زيرا از لحاظ ساختمان شيميايي نزديك به نمونه اتانول است بنابراين ضمن اينكه پيك هاي مربوط به هر كدام جدا مي باشد، خيلي هم از هم فاصله ندارند.

  

تفاوت HPLC با GC:

 

1- چون اغلب مواد آلي ناپايدار و كم فرار هستند. براي كار با GC بايد آنها را به مشتقات فرار تبديل كرد كه ايجاد مشتقات فرار و باقی ماندن جزئي از مصرف مشتق ساز ايجاد پيك هائي مي كند كه نتايج آزمايش را مختل مي سازد حال آنكه جداسازي اين گونه مواد با HPLC به آساني امكان پذير است.

2- دو فاز ثابت و متحرك در HPLC بطور رقابتي عمل مي كنند و جداسازي بوسيله دو فاز انجام مي شود در صورتي كه در GC يك فاز يعني فاز ثابت عمل جداسازي را انجام مي دهد.

3- يكي از مزاياي HPLC وجود دتكتورهاي آنست كه براي هر دسته از تركيبات دتكتورهاي انتخابي ويژه وجود دارد كه اين تنوع دتكتورها از مزاياي HPLC است. در صورتي كه در GC دتكتور ها محدود تر می باشد.

5- مدت آناليز در HPLC فوق العاده اندك است، آناليز تركيبات آلي ناپايدار و كم فرار مواد خوراكي، شيميايي داروئي توسط HPLC امكان پذير است.

6- مواد بسيار قطبي را با GC نمي توان آناليز كرد در صورتي كه با HPLC مي شود.

7-  در HPLC به سبب دو فاز رقابتي پيك ها معمولا بصورت متقارن هستند در صورتي كه در GC اغلب پيك ها بصورت نامتقارن هستند و محاسبه مساحت زير منحني يا AUC با اشكال و خطا است. ولي در HPLC بعلت وجود تقارن محاسبه AUC دقيق انجام مي شود.

8- وجود آب در نمونه هاي آزمايش در HPLC اشكال ايجاد نمي كند در صورتي كه در GC وجود اندك آب سبب تخريب دتكتور مي شود.

9- وجود آب در شبكه كريستالي، وجود مولكولهاي آب ئيدروژن در HPLC قابل تشخيص ولي در GC قابل ارزيابي نيست.

10- وجود ناخالص ها بخصوص ناخالصي هاي بسيار قطبي و يا با وزن مولكولي بالا در HPLC قابل تشخيص ولي در GC قابل تشخيص نيست.

 

 

 

مقايسه حوزه كاركرد، محدوديت ها و امتيازات سيستم GC و HPLC

GC

HPLC

1- تركيبات آلي بسيار ناپايدار را نمي توان مستقيما مورد آناليز قرار داد و بايد توسط معرفهاي خاصي، از نظر شيميائي آنها را بصورت تركيبات مناسب براي آناليز با GC در آورد. اين معرفها را تركيبات مشتق ساز مي گويند.   2- تركيبات آلي با فراريت اندك را نمي توان مستقيما آناليز كرد و بايد توسط عوامل مشتق ساز آنها را به تركيبات مناسب تبديل نمود.   3- آناليز مواد داروئي، خوراكي، صنايع سنگين (مثل پليمرها) و مواد شيمي حياتي به سادگي امكان پذير بوده و مستلزم برنامه بنديهائي با شرايط دشوار و پيچيده است. در هر صورت بهره دهي GC در موارد مزبور چندان رضايت بخش نيست.   4- اغلب آناليزهاي GC نيازمند دماهاي زياد است كه كنترل مقدار دماي اپتيمم پارامتر مشكلي بوده و اغلب منجر به ايجاد پيكهاي نامتقارن مي شود.   5- در سيستم GC فاز ثابت و فاز متحرك با مكانيسم رقابتي همسان عمل نمي كنند و عمدتا يك فاز (فاز ثابت) موجب جداسازي مي گردد. در قياس با عملكرد رقابتي دو فاز (ثابت و متحرك) HPLC، افت شديدي در كم و كيف آناليز ايجاد مي شود. 6- تركيبات متعددي از گونه هاي مختلف وجود دارند كه سيستم GC قادر به آناليز آنها نيست. آناليز اين اجسام با سيستم HPLC امكان پذير نيست.   7- در GC بیشتر سه نوع دتكتور ECD, FID و TCD به كار گرفته مي شود و براي دسته تركيبات خاص دتكتورهاي ويژه اي ابداع نشده است. اين امر يكي از محدوديت هاي بزرگ GC در مقايسه با HPLC است.       8- به كارگيري GC و دست يابي به شرايط لازم و مناسب، دشوار و پيچيده است.   9- آناليز كمي اجسام در قياس با HPLC از حساسيت و دقت كمتري برخوردار است.     10- مواد بسيار قطبي را نمي توان مستقيما تحت آناليز قرار داد.   11- روند مشتق سازي براي تبديل مواد آزمايشي به تركيبات مناسب براي آناليز، با مشكلات عديده اي مواجه است.   12- باقي ماندن مقادير بسيار اندك عوامل مشتق ساز موجب پيدايش پيكهاي ناخواسته مي گردد كه در نهايت استنتاج پيكهاي حاصل از نمونه آزمايشي را دشوار نموده و يا حتي با پيكهاي مزبور تداخل يافته و تفسير كروماتوگرام را عملا ناممكن مي نمايد.   13- به سبب جذب مواد آزمايشي توسط فاز ثابت، اغلب پيكها بصورت نامتقارن ايجاد مي شوند.   14- وجود ناخالصي هاي بسيار قطبي، در نمونه آزمايشي قابل تشخيص نيست.   15- وجود ناخالصي هائي با وزن ملكولي بسيار بالا قابل تشخيص نيست.   16- به سبب عدم مشخص شدن ناخالصي هاي بسيار قطبي و يا با وزن ملكولي بالا، لازم است كه پيش از كروماتوگرافي، توسط افزارهائي نظير UV و IR خلوص مواد آزمايشي تحت بررسي قرار گيرد.   17- استناد پذيري قاطع يك پيك به يك جسم امكان پذير نيست (بنا به دلايل بالا)   18- عدم وجود تقارن در پيكهاي بدست آمده، محاسبه مساحت سطح زير منحني (AUC) را با اشكالات و خطاهاي فراوان مواجه مي كند و در نهايت دقت آناليز مخدوش مي شود.   19- وجود مقادير بسيار اندك آب در نمونه هاي آزمايشي باعث تخريب دتكتور FID و ED مي گردد.   20- ملكولهاي آب موجود در شبكه كريستالي اجسام توسط GC  قابل ارزيابي نيست.   21- ملكولهاي آب واجد بند هيدروژني قابل ارزيابي نيست.   22- افت چشم گير كارائي و بهره دهي ستون هاي GC در كاربردهاي زياد موردي معمولي است.   23- مدت زمان لازم براي آناليز طولاني است.     24- كاربرد كروماتوگرافي فرآوري در مقياس وسيع امكان پذير نيست.   25- افت ميزان آشكارسازي ستونها در بكارگيري زياد آنها در GC موردي عادي و معمولي است.   26- عدم سهولت تجديد پذيري و دشواري خاص آن به لحاظ پارامترهاي مختلف جزو محدوديت هاي سيستم GC است.

1- تركيبات آلي بسيار ناپايدار به سادگي تحت آناليز قرار مي گيرند.           2- تركيبات آلي كه به طور كافي فرار نمي باشند به راحتي مورد آناليز قرار مي گيرند.     3- آناليز مواد داروئي، خوراكي، صنايع سنگين و مواد شيمي- حياتي با بهره دهي و كارايي بسيار برجسته و چشم گير انجام پذيرست.         4- آناليزهاي HPLC در دماي معمولي انجام پذير بوده و يا نيازمند دماهاي اندكي است.       5- در سيستم HPLC دو فاز ثابت و متحرك با مكانيسم رقابتي عمل مي كنند كه در مقايسه با يك فاز موجود در GC (فاز ثابت) موجب انجام آناليزهاي دقيق مي گردند.     6- تركيبات مختلفي كه آناليز آنها توسط GC امكان ناپذيرست با HPLC به راحتي آناليز مي گردند.     7- در سيستم HPLC براي هر دسته تركيبات خاص، دتكتورهاي انتخابي ويژه وجود دارد كه كم و كيف آناليز را به بهترين وجه ممكن افزايش مي دهند وجود اين چنين دتكتورهاي انتخابي، فراز عمده اي در سيستم HPLC محسوب مي شود. (توضيح بيشتر دتكتورهاي HPLC در صفحات بعد درج شده است.   8- به كارگيري HPLC بسيار آسان است.     9- آناليز كمي اجسام با حساسيت و دقت فوق العاده اي امكان پذيرست (به علت افزارمندي خاص HPLC)   10- مواد بسيار قطبي به راحتي تحت آناليز قرار مي گيرند.   11- به علت حوزه وسيع كارائي HPLC معمولا به روند مشتق سازي نيازي نيست.     12- به علت به كارگيري مواد آزمايشي بدان صورتي كه وجود دارند و نيز به سبب عدم نياز به روند مشتق سازي و عدم وجود بقاياي بسيار اندك عوامل مشتق ساز، استنتاج كروماتوگرام به راحتی انجام مي گيرد.     13- به سبب وجود دو فاز رقابتي معمولا پيكها بصورت متقارن ايجاد مي شوند.     14- وجود هرگونه ناخالصي با قطبيت هاي مختلف، قابل تشخيص است.   15- وجود ناخالصي هائي با وزن ملكولي بسيار بالا قابل تشخيص است.   16- به سبب مشخص شدن هرگونه ناخالصي نيازي به استفاده از افزارهاي UV و IR جهت تعيين خلوص جسم وجود ندارد.       17- بنا به دلايل بالا استناد قطعي يك پيك به جسم خاصي امكان پذيرست.   18- به علت وجود تقارن در پيكها، محاسبه دقيق (AUC) و بالمال ارزيابي كمي بسيار دقيق آنها امكان پذيرست.     19- وجود آب در نمونه هاي آزمايشي اشكالي در كل آناليز ايجاد نمي كند.     20- ملكولهاي آب موجود در شبكه كريستالي اجسام قابل ارزيابي است.   21- ملكولهاي آب واجد بند هيدروژني قابل ارزيابي است.   22- كارائي ستونهاي HPLC در بكارگيري هاي فراوان افت قابل توجهي نمي يابند.     23- مدت زمان لازم براي آناليز بسيار اندك است.   24- كاربرد كروماتوگرافي فرآوري در مقياسهاي وسيع امكان پذيرست.   25- قدرت آشكارسازي بيشتر ستونها حتي در صورت به كارگيري بسيار زياد آنها جزو امتيازات چشم گير سيستم HPLC است.   26- سهولت تجديد پذيري (Reproducibility) در سيستم HPLC از فزارهاي عمده اين سيستم محسوب مي شود.

 

  

«گاز کروماتوگرافی جرمی   GC-Mass»

 

 

شناسايي دستگاه GC-Mass

 

مشابه دستگاه GC است. تنها تفاوت آن با GC معمولی اين است كه در اين دستگاه دتكتور مربوطه دتکتور Mass است .تفاوتهاي ديگر آن عبارتند از 1- از ستون موئينه (كاپيلري) استفاده مي كنيم. نوع ستون به اسم تجارتي DB-5 است. از نظر پلاريته ستون داراي پلاريته متوسطي است. طولش m30است و براي كارهاي عمومي استفاده مي شود از آنجا كه عوض كردن ستون زياد ساده نمي باشد. سعي مي كنيم ستوني را انتخاب كنيم كه نمونه هاي زيادي را با آن تعيين كنيم.
2- احتياج به حجم نمونه خيلي كمي براي تزريق داريم. معمولا 0.1 ميكروليتر حجم تزريق است، گاهي همين ml0.1 هم براي تزريق به اين دستگاه زياد است پس از سيستمي كه براي رقيق كردن نمونه است و split يا spliless نام دارد استفاده مي كنيم. Split يعني چند شاخه شدن يعنی نمونه ای که به دستگاه تزريق می کنيم عدد split را به دستگاه می دهيم .مثلا100،نمونه به همان مقدار تقسيم شده و يكي از آن قسمتها وارد دستگاه مي شود.

گاهي نمونه خالص، خيلي غليظ است و حتي با طريق split خط پايه خوبي ندارد. پس اين نمونه ها را رقيق مي كنيم (معمولا با متانل) مجبوريم ml 0.2-0.1 از نمونه را تزريق كنيم، چون حجم حلال زياد و حجم نمونه كم است كه در اينجا به مقدار زياد حلال به دستگاه مي رسد كه ممكن است فشار زیادی به دستگاه وارد کند، بنابراين به اندازه R_t حلال به دستگاه delay (تاخير) مي دهيم تا فيلاماندستگاه پس از خروج حلال روشن شود، كه متانل بعد از 2 دقيقه مي آيد، يعني دستگاه 2 دقيقه طیف جرم نمی گیرد.

در Mass احتياج داريم كه مقادير ميكروگرم از نمونه را تحت شرايط خلا بخار نموده و از آن طيف بگيريم . پس نياز به خلا داريم كه توسط توربوپمپ Turbo pump خلا mmHg ^7-10 ايجاد مي شود. دو طريق عمده براي يونيزاسيون نمونه داريم: 1- طريقه Electron Ionization الكترون يونيزاسيون (EI): كه انرژي حدود ^ev 70 به جسم اعمال مي شود. مقدار شكست ها خيلي زياد است، پس اطلاعات راجع به ساختمان شيميائي جسم بيشتر مي شود. تنها اشكال آن نديدن پيك يون ملكولي در برخي اوقات است.

2- روش chemical Ionization يونيزاسيون شيميايي (C.I): از گاز متان، ايزوبوتان، آمونياك براي شكستن جسم استفاده مي كنيم كه طريق نرم تري است ولي يون ملكولي را مي بينيم.ما به روش EI كار مي كنيم.

در شروع كار با دستگاه بايدتشکیل خلا را چك كنيم كه به ميزان قابل قبولي رسيده باشد به خاطر اينكه وجود آب پیک (18)، ازت (28)، اكسيژن (32) را ایجاد می کنند.با این حال معمولا وقتي طيف Mass مي گيريم به آن برنامه مي دهيم كه از mass 40 به بالا را بگيرد.

لازم است كه ماهي يكبار كاليبراسيون را براي دستگاه انجام مي دهيم، يعني از يك جسم استاندارد طيف Mass بگيريم و ببنيم آيا مطابقت دارد يا نه؟ استاندارد: پرفلوروتري بوتيل آمين كه در داخل خود دستگاه در داخل يك شيشه كوچك تعبيه شده اين جسم داراي پيك هاي شارپي در نواحي به خصوصي هست، اگر دستگاه بتواند اين پيك ها را پيدا كند، در آن صورت اعلام مي دارد كه آيا دستگاه كاليبره هست يا نه.

مزيت ديگر اين دستگاه: امكان جستجو در كتابخانه (Library) دستگاه هست، بعد از گرفتن طيف مي توان در كتابخانه دستگاه رفته و search يا جستجو نمود. براي هر گروه از مواد، كتابخانه جداگانه اي وجود دارد. دستگاه 10 كانديد را پيشنهاد مي كند.

فاكتور P (purity) درصد احتمال صحت كانديداها را نشان مي دهد كه اگر بالاتر از 80% (اعداد بالاتر از 800)  باشد، قابل قيول است.

اگر فاكتور P از 800 به بالا بود، به معني اين است كه جسم با احتمال بيش از 80%  همان كانديد است. فرض كنيم پيك جسمي از 3 فراكشن C,B,A تشكيل شده باشد. اين دستگاه ضمن اينكه كروماتوگرام را به ما مي دهد، طيف Mass را نيز به ما مي دهد. يعني از هر جزء (Fragment) طيف Mass گرفته مي شود.

تنها محدوديت اين دستگاه اين است كه چون سيستم وارد كننده نمونه به دستگاه GC, Mass است. پس در واقع تنها موادي را مي توان با GC شناسائي نمود كه فرار باشند يا از آنها بتوان مواد فرار (توسط مواد مشتق ساز مواد فرار) تهيه كرد. مواد مشتق ساز عبارتند از: مشتقات سيليس (تري ميتل سيلان) كه با جسم ايجاد مشتقات فرار قابل تزريق به GC را مي نمايند.

قسمتهای مختلف دستگاه:

1- مخزن هليم: He با خلوص بسيار بالا

2- injector: فلوي گاز حامل را روي Psi 12 تنطيم مي كنيم. در قسمت split flow . ميزان رقيق شدن نمونه را تعيين مي كنيم، يعني نمونه با گاز حامل تقسيم به نسبت مي شود و تنها به نسبت 1به عدد تقسيم وارد ستون مي گردد. ممكن است قسمت GC با يك دتكتور FID به عنوان يك بخش مستقل استفاده شود.

3- ستون: از نوع كاپيلري   طول: 30m                      نوع DB-5

بعد از مدتي ستون كثيف مي شود كه بايد آن را مجددا احياء (رژنره) كنيم، براي اين كار مدتي ستون را در دماي ° 215-200 قرار مي دهيم تا اشغالها بسوزد. پس از چند بار با اين روش هم ديگر نمي توان ستون را احياء مجدد نمود، و بايد cm 20 اول ستون را قطع نمود، چرا كه اغلب اشغالها در cm 20 اول ستون هستند.

4- detector( دتکتور همان دستگاه Mass می باشد.

5- Recorder

6- براي قسمت Mass احتياج به پمپ براي ايجاد خلا داريم

براي كار با دستگاه : ابتدا وارد بخش Instrumental control مي شويم كه در اينجا ميزان آب و هوا را مشاهده مي كنيم. سپس calibration Mass انجام مي شود كه پيكهاي استاندارد پيدا شده و منحني استاندارد رسم مي شود. اگر در هر بخش اشكالي ايجاد شود، در بخش Diagnostics اشكال را پيدا مي كنيم.

سپس در بخش analysis موارد زير تعيين مي شود:

نام فايل مشخص مي شود. 1- Data file

پارامترهايي مثل: دما، زمان و... مشخص مي شود 2-GC Method

مشخصات فوق مي تواند توسط فرد تعيين شود (با Edit) و يا پيش فرضهاي دستگاه پذيرفته شود با فشار دادن كليد C، مي توان كروماتوگرام تركيب را بدست آورد و با كليد F₁ از هر محل دلخواه كروماتوگرام به طيف Mass را بدست آورد.

همچنين در بخش Chrome analysis مي توان كروماتوگرام ماده را مشاهده كرد، بخشي از آن را بزرگ كرد و از هر قسمت دلخواه طيف Massرا بدست آورد.

پس از رسم طيف Mass با فشار دادن كليد L وارد كتابخانه (Library) دستگاه مي شويم كه
مي توان در اين بخش تركيب را در كتابخانه موردنظر (مثلا  Libraryترپنوئيدها، و ...) جستجو Search نمود. همانطور كه گفته شد فقط انتخابهايي كه purity بالاتر از 800  قابل قبول مي باشد. در نهايت خاموش كردن دستگاه را مي توان بصورت دستي (manual) انجام داد يا از قسمت shut down استفاده نمود كه انجام مراحل خاموش كردن دستگاه، چند ساعت طول
مي كشد********

 

اساس كار با دستگاه

 

به ازاي تعداد فراكسيونهاي موجود در اساس در كروماتوگرام پيك ظاهر مي شود. در كروماتوگرام محور Xها مشخص كننده R_t و محور yها تعيين كننده شدت پيك هاست، طوري كه با اندازه گيري AUC مي توانيم تعيين مقدار كنيم و نيز با R_t شناسايي كيفي انجام مي دهيم.

تفاوت اين دستگاه با GC اينست كه در اينجا از هر فراكسيون در دستگاه Mass طيف جرم گرفته مي شود. در اين طيف هاي جرم پيك ها تك شاخه ايست. فراواني Base peak ، 100% است و بلندترين پيك انتهايي پيك يون مولكولي مي باشد. بعد از انتخاب پيك مربوط به هر فراكسيون در طيف كروماتوگرام تعيين (scan number)، دستگاه طيف جرم مربوط به آن را رسم كرده سپس طيف جرم را به كتابخانه دستگاه برده و برحسب درصد انطباق براي هر طيف 10 تا كانديدا مي دهد.

در اين دستگاه GC و Mass از هم جدا نمي شود و طرز وارد كردن نمونه به دستگاه Mass  از طريق GC مي باشد، بنابراين در اين دستگاه، فقط از نمونه هايي مي توانيم طيف جرم تهيه كنيم كه بتوانيم به GC تزريق نمائيم. پس به طور عمده اين دستگاه براي شناسايي و تعيين مقدار فراكسيونهاي اسانس هاست كه مواد فرار هستند.

ستون دستگاه GC از نوع لوله موئينه است زيرا بايد حجم نمونه كم باشد تا طيف جرمي خوبي به دست آيد. براي كاهش حجم نمونه چند كار انجام مي شود: يك راه رقيق كردن اسانس با حلال (معمولا متانول) است و يا مي توان به جاي تزريق، فقط سرسوزن را به اسانس آغشته نمود. اما بازهم گاه مشاهده مي شود كه تنها با رقيق كردن، پيك ها از صفحه بيرون مي زند. به همين منظور در دستگاه سيستم Split  طراحي شده كه اين سيستم آنچه را كه از طريق injector وارد دستگاه مي شود، تقسيم مي كند و يك قسمت را وارد ستون كرده و بقيه را از پشت دستگاه خارج مي كند كه براساس ميزان فلويي كه ما براي دستگاه مشخص مي كنيم اين تقسيم صورت مي گيرد كه حداكثر آن معمولا 300/1 است.

براي شروع كار با دستگاه روش كار با دستگاه، بايد مطمئن شويم كه در دستگاه خلا برقرار شده زيرا بايد طيف جرم را در خلا بگيريم. سپس بايد دستگاه را كاليبره كنيم. به اين منظور از ماده پرفلوئورو تري بوتيل آمين استفاده مي كنيم.

دستگاه اين ماده را با FC-43 مي شناسد. اين تركيب داراي 6 پيك مشخص است و اگر اين پيك ها سرجايشان بودند يعني دستگاه درست كار مي كند. اين ماده را ما به دستگاه تزريق نمي كنيم، بلكه به دستگاه برنامه اي مي دهيم تا براساس اين ماده كاليبره شود، يعني قبل از شروع هر كاري وقتي مطمئن شديم خلا برقرار شده يك برنامه به دستگاه مي دهيم تا از استاندارد استفاده كند.

در مرحله بعد بايد متدهاي GC و Mass را مشخص كنيم.

متدي كه براي GC انتخاب مي كنيم ESS است. اين متد تركيبي ازمتد ايزوترمال به مدت min 10 و بعد پروگراميك  است كه در آن دماي شروع و اتمام كار مشخص است. در متدي كه براي Mass انتخاب مي كنيم Mass range مشخص مي شود كه معمولا اين محدود را از 40 تا 300 مي گيريم. زيرا در محدوده كمتر از 40 پيك نداريم و نيز در اين جا مزاحمت هايي هم وجود دارد. در متد Mass يك مدت زمان تاخير (delay time) هم در نظر مي گيريم، در اين مدت فقط حلال (متانول) از دستگاه خارج مي شود و طيف جرم آنرا نمي گيريم بنابراين در دو دقيقه اول پيكي رسم نمي شود. علت اين كار اينست كه تعداد مولكول هاي متانول نسبت به جرم ماده نمونه زياد است كه اگر طيف جرم آن را بگيريم فشار زيادي به دستگاه مي آيد.

در متد Mass روش گرفتن طيف جرم (Ionization mode) را هم مشخص مي كنيم. به طور كلي دو روش وجود دارد EI(Electron Ionization) و CI(Chemical Ionization) كه ما در اين جا از روش EI استفاده مي كنيم.شکسته شدن به روش EI شديدتر از CI است و در اين روش طيف هاي بيشتري مشاهده مي شود زيرا شكست ها بيشتر است و ممكن است يون مولكولي مشاهده نشود.

ستون دستگاه با اسم تجارتي DB-5، داراي پلاريته متوسط بوده و در آن از گاز هليوم به عنوان حامل استفاده مي شود. (در اينجا از گاز ازت براي شكستن خلا استفاده مي كنيم). اگر ببنيم كيفيت ستون كاهش يافته (به علت چسبيدن ماده به آن كارايي كم شده باشد) 10-20 سانتي متر اول ستون را قطع مي كنيم. ستون از يك طرف به سيستم تزريق و از طرف ديگر به دتكتور وصل است. مي توان تا 300 فلواسپليت داشته باشيم. آنچه به ستون تزريق مي شود با گاز حامل مخلوط شده و بعد تقسيم مي شود.

در قسمت Instrumental control بايد چك كنيم كه در قسمت خلا آب و هوا نباشد بعد وارد قسمت آناليز شده و متدهاي مورد نظر را به دستگاه download مي كنيم. سپس بايد منتظر بمانيم تا دستگاه GC  گرم و آماده شود. وقتي چراغ GC روشن شد آماده تزريق خواهد بود. در اينجا مدت تزريق 70 دقيقه طول مي كشد. هر چه طيف جرم را با غلظت كمتر بگيريم. طيف بهتري خواهيم داشت مثلا اگر فراكسيون A در بين دقيقه هاي 3تا5 بيرون آمده در هر ثاينه آن يك طيف جرم گرفته مي شود و معمولا طيف جرم از راس پيك با ابتدا و انتهاي پيك متفاوت است زيرا در قسمت راس غلظت فراكسيونها بيشتر است. غلظت بيشتر باعث شلوغ شدن طيف جرم مي شود. بنابراين از طيف هاي جرم پاي پيك يعني با scan number پائين تر براي بردن به كتابخانه استفاده مي كنيم.

در دستگاه كتابخانه هاي مختلفي براي جستجو وجود دارد كه كتابخانه ترپن ها بهترين كتابخانه براي جستجوي اسانس هاست. (البته كتابخانه هاي بزرگ ديگري هم وجود دارد).گاه نتايج بسيار متنوعي با جستجو در كتابخانه هاي مختلف مشاهده مي شود. معيار قبول كردن كانديداها فاكتور purity مي باشد كه حداكثر آن 1000 است و نشاندهنده انطباق 100% مي باشد. معيار قبولي كانديدا purity برابر 800 را انطباق 80% است. و معمولا سه كانديداي اول اهميت بيشتري دارند يادداشت مي شوند.

 

 

کروماتوگرافی تبادل یونی

اطلاعات اولیه

        کروماتوگرافی تبادل یونی در ستون‌ها ، بطور انحصاری ، کاربرد رزین‌های تبادل یونی محدود می‌شود زیرا این مواد به طور عمده خواص مطلوبی ، مانند پایداری مکانیکی و شیمیایی و یکنواختی اندازه دانه‌ها ( ذرات ) دارند، پودر سلولز که آن گرده‌های تبادل یونی به طریق شیمیایی قرار داده شده باشند نیز برای جداسازی مواددر ستون‌ها به کار می‌رود. ورقه‌هایی از سلولز عمل شده فوق و ورقه‌های سلولز پر شده با رزین‌های تبادل یونی را در روش کروموتوگرافی کاغذی برای جداسازی‌هایی که شامل تبادل یونی هستند، می‌توان مورد استفاده قرار داد.

توصیف

          در کروماتوگرافی تبادل یونی جداسازی مواد از نوع کروماتوگرافی که در آنها رزین به جای جاذب در کروماتوگرافی جذبی قرار می‌گیرد، است. مقادیر زیادی از رزین‌های تبادل یونی برای جدا کردن کامل یون‌ها از محلول در آزمایشگاه و نیز در مقیاس صنعتی به کار می‌روند. یعنی از جداسازی‌های فوق العاده جالب عبارتند از جداسازی مواد لانتایندها، آکتینیدها و اسیدهای آمینه.

رزین‌های متداول تبادل یونی

      رزین‌های متداول تبادل یونی که به طور مصنوعی ساخته می‌شوند، بر پایه قالب غیر محلولی از یک بسپار بزرگ ، معمولا پلی استیرن ، استوار هستند. ولی بعضی از آنها متکی بر اسید متا اکریلیک هستند. نوع اول با بسپار کردن استیرن در حضور مقدار کمی از دی وینیل بنزن ساخته می‌شود. دی وینیل بنرن میزان اتصالات عرضی را که عامل مهمی در کروماتوگرافی است کنترل می‌کند. اتصالات عرضی ، بسپار را به حالت نامحلول در می‌آورد. اگر میزان اتصالات عرضی خیلی کم باشد رزین مستعد جذب مایع اضافی می‌شود و در نتیجه آماس زیادی می‌کند، در حالی که اتصالات عرضی زیاده از حد ، ظرفیت تبادل رزین را ، احتمالا به علت ممانعت فضایی کم می‌کند. 

         گرده‌های قطبی که باعث خواص تبادل یون در رزین می شوند به جز در مورد اسید پلی متا اکریلیک، بعد از عمل بسپار شدن به رزین اضافه می‌شوند. با بسپار شدن در یک امولسیون آبی می‌توان دانه‌هایی با اندازه‌های معین تهیه کرد و در این صورت است که رزین‌ها برای عمل یون زدایی و اهداف کروماتوگرافی به کار می‌روند. بعضی از رزین‌ها را به شکل ورقه می‌سازند که در این صورت غشاهای تبادل یونی به دست می‌آیند. این غشاها به این صورت کاربردی در کروماتوگرافی ندارند ولی می‌توان از آنها برای نمک‌زدایی محلول‌ها ، که ممکن است یک عمل مقدماتی ضروری برای یک جداسازی مواد کروماتوگرافی مورد نظر باشد، استفاده کرد.

• مواد مبادله کننده یون : تبادل گرهای کاتیونی و آنیونی دو نوع عمده مواد مبادله کننده یون هستند که آنها را به نوبه خود می‌توان بر حسب قدرتشان به اسید و باز تقسیم‌بندی کرد.
• تبادل‌گر کاتیونی : گروه‌های قطبی در تبادل‌گرهای کاتیونی، که یا و یا می‌باشند، خاصیت اسیدی دارند این گروه‌‌ها به مولکول‌های بسپار به طور قطعی متصل هستند و در معرض محلول‌ حاوی یون‌هایی که باید حذف یا جدا شوند، قرار می‌گیرند.
• گروه‌های قطبی در تبادل گرهای آنیونی گروه‌های آمونیوم نوع سوم یا چهارم هستند و مثل هم عمل می‌کنند. تبادل‌گر آنیونی بیشتر به شکل کلرید هستند تا به شکل هیدروکسید زیرا کلریدها پایدارتر هستند.

خواص رزین‌ها

• باید دارای گروه‌های مبادله کننده تک عاملی باشد. برای رزین‌های جدید هیچ مشکلی در این مورد وجود ندارد ولی محصولات اولیه که از فنل ساخته می‌شدند چند عاملی بودند و خواص تبادل آنها بستگی به PH محلولی که در آن قرار می‌‌گرفتند، داشت. از این نقطه نظر این رزین‌ها برای کروماتوگرافی مناسب نبودند.
• باید درجه اتصالات عرضی کنترل شده داشته باشد. 4 - 8 % بهترین درجه برای کروماتوگرافی است.
• گستره اندازه ذرات باید تا آنجایی که ممکن است کوچک باشد.
• اندازه ذرات باید، تا آنجایی که عملی است کوچک باشد.

مزیت اساسی کروماتوگرافی تبادل یونی

     در کروماتوگرافی ، محلول‌های بکار رفته اکثرا رقیق هستند و در نتیجه روش شستشو بیشتر به کار می‌رود و اغلب جداسازی‌های بسیار رضایت بخشی به دست می‌آید. در مورد رزین‌ها تجزیه جانشینی و تجزیه مرحله‌ای و شستشوی تدریجی همگی به کار می‌روند. ولی از تجزیه جبهه‌ای استفاده نمی‌شود. روش دیگر شستشو ، تحت عنوان گزینش پذیری ، نیز کارآیی مفیدی دارد. این روش به تغییر فعالیت یون‌هایی بستگی دارد که باید بوسیله عامل شوینده‌ای که با یون‌ها تشکیل کمپلکس می‌دهد جدا شوند.

      تشکیل کمپکس بدون شک عامل مهمی در سایر روش‌های کروماتوگرافی ، مخصوصا در جداسازی‌های معدنی روی کاغذ است، ولی در هیچ یک از سایر روش‌ها این موضوع به همان وسعت که در کروماتوگرافی تبادل یونی استفاده شده، مطالعه نشده است. یکی از قدیمیترین و جالب‌ترین موفقیت‌ها در کروماتوگرافی تبادل یونی جداسازی مواد لانتایندها در یک رزین اسید قوی و با استفاده از یک محلول سیترات تامپونی برای شستشو است.

کروماتوگرافی نمک زنی

          در روش کروماتوگرافی نمک‌زنی ، از رزین‌های تبادل یونی برای جداسازی موادغیر الکترولیت‌ها ، با شستن آنها از ستون به وسیله محلول‌های آبی یک نمک ، استفاده می‌شود. اجسام جدا شده بوسیله این روش ، اترها ، آلدئیدها ، کتون‌ها و آمین‌ها هستند.

تبادل‌گرهای یون معدنی

          بعضی از نمک‌های معدنی برای پر کردن کاغذ و آماده سازی آن به منظور استفاده در جداسازی‌ها که بر اثر تبادل یون صورت می‌گیرند، بکار می‌روند. یکی از دلایل توجه به مواد معدنی این است که تبادل‌گرهای یونی رزینی بر اثر تابش مستعد خراب شدن هستند. بنابراین در حقیقت برای استفاده با محلول‌های خیلی فعال مناسب نیستند. اگر چه برای جداسازی مواد ، به عنوان مثال ، مخلوط‌های اکتیندها یا موفقیت به کاربرده شده‌اند. مواد معدنی دارای مزایای دیگری مانند گزینش پذیری خیلی زیاد برای بعضی از یون‌ها مانند روبیدیم و سزیم و توانایی در برابر محلو‌ل‌های با دمای بالا هستند. 

    به علاوه تبادل گرهای یونی معدنی وقتی که در آب قرار می‌گیرند به مقدار قابل توجهی آماس نمی‌کنند و حجم آنها با تغییر قدرت یونی محلول در تماس با آنها تغییر نمی‌کند. از طرف دیگر ، بعضی از مواد معدنی معایبی مانند انحلال پذیری یا والختی در بعضی از PHها که در آن معمولا رزین‌ها پایدارند، دارند یا ممکن است در محلول‌هایی که رزین‌ها غیر محلول هستند، حل شوند. همچنین تبادل‌گرهای یونی معدنی ممکن است به شکل بلورهای ریز باشند که به علت ممانعت از عبور فاز متحرک ، برای پر کردن در ستون‌ها مناسب نیستند. اگر چه راههایی برای فائق آمدن به این مشکل وجود دارد.

 

 

تخلیص پروتئین با روش FPLC

چکیده:

تجزیه، تخلیص و شناسایی پروتئین‌ها، که هر‌کدام از آن‌ها وظیفه‌ی خاصی در بدن موجودات زنده بر‌عهده دارند، در پیشرفت علوم زیستی، بیوتکنولوژی، پزشکی و صنعت دارو اهمیت خیلی زیادی پیدا‌کرده‌است. برای تخلیص پروتئین‌ها ابتدا باید غشای سلول را تخریب و سپس محتویات داخل سلول را استخراج نمود. برای جداسازی پروتئین‌های موجود در محتویات داخل سلول از سایر اجزا، معمولا از روش رسوب دهی با نمک آمونیوم سولفات، فیلتراسیون و سانتریفیوژ استفاده می‌شود. برای خالص‌سازی پروتئین مورد‌نظر و جداسازی آن از مخلوط پروتئینی به‌‌دست‌آمده می‌توان روش‌های متعددی از‌ جمله الکتروفورز دو بعدی، انواع روش‌های کروماتوگرافی (مانند کروماتوگرافی تبادل یون، کروماتوگرافی اندازه طردی، کروماتوگرافی میل‌ترکیبی و کروماتوگرافی برهم‌کنش آبگریزی) استفاده نمود. این روش‌ها قدرت‌تفکیک زیادی دارند اما بسیار زمان‌بر هستند. برای رفع این مشکل، از روش کروماتوگرافی مایع با عملکرد سریع Fast Performance Liquid Chromatography استفاده می‌نمایند. این روش در سال 1982 در سوئد، توسط Pharmacia گسترش پیدا‌ کرد و تجاری‌ شد. به دلیل این‌که این روش بیشتر برای تخلیص پروتئین‌ها به کار می‌رود، آن را  Fast Protein Liquid Chromatography نیز می‌نامند. روش FPLC، جداسازی پروتئین را در زمان بسیار کوتاه‌تر نسبت‌به سایر روش‌ها‌ امکان‌پذیر می‌سازد. و با توجه به این‌که در صنعت، برای تخلیص پروتئین در مقیاس انبوه، پارامتر زمان بسیار اهمیت دارد، اخیرا این روش به شکل خیلی گسترده‌ مورد استفاده قرار می‌گیرد. از دیگر مزایای این روش، ساده بودن کار با سیستم FPLC و در عین حال مقرون به صرفه بودن آن از لحاظ اقتصادی است. قابل ذکر است که این روش همه‌ی انواع کروماتوگرافی را در بر می‌گیرد و در هر دو مقیاس تجزیه‌ای و تهیه‌ای قابل استفاده است. روش FPLC علاوه بر پروتئین‌ها برای تخلیص سایر بیومولکول‌ها مانند لیپو‌پروتئین‌ها، RNA و DNA نیز کاربرد دارد.

References:

ÄKTAFPLC SYSTEM MANUAL, Amersham Pharmacia biotech, Edition AB, 18-1140-45.

Protein purification handbook, Amersham biosciences, Edition AC, 18-1132-29.

 

کروماتوگرافی مایع - طیف سنج جرمی (LC-MS)

روش ﮐﺮوﻣﺎﺗﻮﮔﺮاﻓﻰ ﻣﺎﯾﻊ - ﻃﯿﻒ ﺳﻨﺠﻰ ﺟﺮﻣﻰ (LC-MS) ﯾﮑﻰ از روش ﻫﺎى آﻧﺎﻟﯿﺰ نمونه های دارویی، غذایی، بیولوژیکی و بیوشیمیایی اﺳﺖ ﮐﻪ بخاطر قدرت و کارایی بالایی که دارد،  ﺳﺮﻋﺖ رﺷﺪ ﺑﺴﯿﺎر ﭼﺸﻢ ﮔﯿﺮى در دو دﻫﻪ ي اﺧﯿﺮ داﺷﺘﻪ اﺳــﺖ و بویژه در آنالیز پروتئین ها، دانش نوظهور پروتئومیکس و ژنومیکس و نیز شناسایی و اندازه گیری بیومولکول های دارویی و داروهای نوترکیب و نیز انواع بیومارکرهای در مایعات بدن از این تکنیک تلفیقی و اتصالی استفاده می شود. همچنین تشخیص سریع دوپینگ  در مسابقات المپیک و ورزشی بسیار مطرح است. در اﯾﻦ روش ﺗﻮاﻧﺎﯾﻰ ﻫﺎى ﯾﮏ ﺳﯿﺴﺘﻢ ﺟﺪاﺳﺎزى با عملکرد بالا ﯾﻌﻨﻰ HPLC به ﻗﺎﺑﻠﯿﺖ ﻫﺎى ﻣﻨﺤﺼﺮ ﺑﻪ ﻓﺮد آﺷﮑﺎرﺳــﺎز های بسیار حساس ﻃﯿﻒ ﺳــﻨﺠﻰ ﺟﺮﻣﻰ با تجزیه گر های جرمی مختلف، از طریق یک رابط ویژه اﺿﺎﻓﻪ ﺷــﺪه اﺳــﺖ و ﺑﺪﯾﻦ ﺗﺮﺗﯿﺐ ﺳﯿﺴــﺘﻤﻰ ﺑــﺎ ﺗﻮاﻧﺎﯾﻰ ﻫﺎى ﮐﻢ ﻧﻈﯿﺮ ﺑﺮاى ﺑﺮآورده ﺳــﺎزى ﻧﯿﺎزﻫﺎى روز اﻓــﺰون و ﻣﺘﻨﻮع ﻋﻠﻢ آﻧﺎﻟﯿﺰ در ﺟﻨﺒﻪ ﻫﺎى ﻣﺨﺘﻠﻒ ﻓﺮاﻫﻢ ﺷــﺪه اﺳﺖ. اﺳــﭙﮑﺘﺮوﻣﺘﺮﻫﺎى ﺟﺮﻣــﻰ با منابع تولید یون مختلف ابتدا ﻣﻮﻟﮑﻮل ﻫﺎى ﺑــﺰرگ را ﻗﻄﻌــﻪ ﻗﻄﻌﻪ و ﺑﻪ اﺟﺰاى ﮐﻮﭼﮏ ﺗﺮ تبدیل می کنند ﺗــﺎ در ﻧﻬﺎﯾﺖ وارد تجزیه گر جرمی شده و جداسازی می شوند و سپس به سمت دتکتور هدایت می شوند تا ﺳﺎﺧﺘﺎر آن ﻫﺎ ﺑﺮ اﯾﻦ اﺳﺎس ﻣﺸﺨﺺ ﺷﻮد. ﺳﯿﺴــﺘﻢ ﻫﺎى ﮐﺮوﻣﺎﺗﻮﮔﺮاﻓﻰ ﻣﺠﻬــﺰ ﺑﻪ ﻃﯿﻒ ﺳــﻨﺞ ﻫﺎى ﺟﺮﻣﻰ ﻣﻰ ﺗﻮاﻧﻨﺪ اﻃﻼﻋﺎت ﺑﺎ ارزﺷــﻰ را در ﻣﻮرد وزن ﻣﻮﻟﮑﻮﻟﻰ، ﺳﺎﺧﺘﺎر، ﺷﻨﺎﺳﺎﯾﻰ، ﺗﻌﯿﯿﻦ ﻣﻘﺪار و ﺧﻠﻮص ﻧﻤﻮﻧﻪ های گوناگون در اﺧﺘﯿــﺎر ﻣﺎ ﻗﺮار دﻫﻨﺪ. ﺑﻪ دلیل اﺧﺘﺼﺎﺻﻰ ﺑﻮدن  ﻃﯿﻒ ﻫــﺎى ﺟﺮﻣﻰ، ﻧﺘﺎﯾﺞ ﺑﻪ دﺳــﺖ آﻣﺪه از آﻧﺎﻟﯿــﺰ ﮐﯿﻔﻰ و ﮐﻤﻰ آن ﻫﺎ ﺑﺴــﯿﺎر ﻗﺎﺑﻞ اﻃﻤﯿﻨﺎن اﻧﺪ و هر گونه ای طیف جرمی خاص خود را دارد که در واقع شناسنامه ی آن ماده محسوب می گردد. طیف سنج های جرمی ﺑﺮاى بیشتر ﺗﺮﮐﯿﺐ ﻫﺎ،  ﻧﺴﺒﺖ ﺑﻪ ﺳﺎﯾﺮ آﺷﮑﺎرﺳﺎزﻫﺎى ﮐﺮوﻣﺎﺗﻮﮔﺮاﻓــﻰ ﻣﺎﯾﻊ ، ﺣﺴــﺎس ﺗﺮند و  اﺧﺘﺼﺎﺻﻰ ﺗﺮ ﻋﻤﻞ میﮐﻨﻨﺪ. با آشکارسازهای جرمی با آنالیزورهای جرمی مختلف ( چهارقطبی یگانه و سه گانه،  قطاع مغناطیسی، لوله ی زمان پرواز ، تله ی یونی Ion Trap و آشکارساز تله ی یونی چرخشی جدید موسوم به Orbitrap ) ﻏﻠﻈﺖ ﻫﺎﯾﻰ در ﺣﺪ ﻧﺎﻧﻮ ﻣﻮﻻر  اندازه گیری می شود.  

 

گونه های جداسازی شده در کروماتوگرافی گازی که  ورودی این دستگاه محسوب می شوند، از طریق رابط وارد ورودی طیف سنج جرمی می شوند که در شرایط خلا بالا قرار دارد و پس از آن در منبع یون که در اینجا بصورت پالس لیزر است  بصورت  یون در می آیند.  یون مولکول‌های تولید شده از یک منبع یون پالسی مانند MALDI یا ( Pulsed Liquid Metal Ion Gun)،توسط میدان الکتریکی قوی متناسب با فرکانس اعمال پالس(اما با یک تاخیر زمانی) در منبع یون، شتاب داده میشوند. آنگاه یون مولکول‌های شتابدار از داخل یک لوله ی زمان پرواز عاری از میدان الکتریکی بطول یک متر عبور میکنند. از آنجایی که تمام یونهای وارد شده به لوله بطور ایده ال دارای انرژی جنبشی یکسان هستند سرعت حرکت آنها در لوله نسبت عکس با جرم دارد. ذرات سبکتر زودتر و ذرات سنگین تر دیرتر به آشکارساز میرسند. از نقطه نظر تفکیک و تکرار پذیری،دستگاههایی برپایه تجزیه گر جرمی زمان پرواز نسبت به تجزیه گرهای جرمی قطاع مغناطیسی و چهارقطبی دارای رضایت بخشی کمتری هستند. اما عواملی همچون سادگی، مقاوم بودن، دسترسی راحت و گستره ی جرمی نامحدود تا حدودی این نا رضایتی را جبران می کند. جداسازی ذرات باردار در  تجزیه گر زمان پرواز بر اساس زمان رسیدن یون ها (Sepatation-in-time) به آنالیزور جرمی و دتکتور است و جداسازی در فضای (Separation in Space) بین چهارقطبی یا قطاع مغناطیسی نیست.  تجزیه جرمی به روش زمان پرواز  به دلیل توانایی خاص آن  در مطالعه ی مولکول های سنگین از اهمیت بالایی برخوردار است. این روش در مطالعات داروسازی و دارویی، تحقیقات زیست محیطی، نمونه های غذایی ،  صنایع عطر و ادوکلن، سم شناسی و نفت و پتروشیمی کاربرد فراوانی دارد.

 

دستگاه کروماتوگرافی یونی روشی سودمند برای اندازه‌گیری آنیون ها و کاتیون ها مختلف درنمونه‌های گوناگون در صنعت، آزمایشگاهها، کلینیکها، محیط زیست و ... می‌باشد. اصول این دستگاه بر پایه ی جداسازی و اندازه‌گیری با آشکارساز هدایت سنجی می‌باشد که این دتکتور به همراه یک اتو ساپرسور، حد تشخیص بسیار خوبی برای آنالیز یونها را دارد، بنابراین بسیاری از مزاحمت ها در حین آنالیز حذف خواهد شد. این روش بسیار سودمند برای آنالیز یونهای  معدنی می‌باشد چرا که هم،  زمان کمتر و همچنین از حد تشخیص بالاتری در مقایسه با سایر روش ها برخوردار است. در بسیاری از موارد نظیر پایشهای زیست محیطی در محیط های آبی، اندازه‌گیری Nutrientها همچون یون های نیترات، فسفات و همچنین آنیونهایی مانند برم، کلر، فلوئور، نیتریت و سولفات و کاتیونهایی همچون سدیم، پتاسیم، کلسیم، منیزیم و باریم و ... بسیار حائز اهمیت می‌باشد. با استفاده از این دستگاه اندازه‌گیری این مواد براحتی و در زمان کمتری در مقایسه با شیمی تر صورت می‌گیرد. از دیگر کاربردهای این دستگاه به توانمندی آنالیز مقادیر کم آنیونهایی نظیر سولفات و نیترات در حضور بالای کلر در نمونه های آب نمک  می‌توان اشاره کرد.  همچنین از این دستگاه در آنالیز نمونه های دارویی، آلودگی های آب،   متابولیت های گیاهی( توتون و تنباکو)، نمونه های آب از منابع مختلف، نمونه های جداشده در اشکال دارویی، محصولات طبیعی (Natural  Products) استفاده می شود.  روش های توسعه یافته یون کروماتوگرافی برای نمونه های گوناگون با اکثر استانداردهای جهانی و آزمایشگاه آکرودیته و مادر تخصصی همخوانی دارند. یون کروماتوگراف های چند کانالی می توانند بصورت همزمان (آنیون و کاتیون) و یا بصورت مجزا ( ابتدا کاتیون و سپس آنیون  و یا برعکس)  آنالیز یون ها را انجام دهند. 

 

کروماتو گرافی کاغذی 

 

آشنایی با این روش: کروماتوگرافی کاغذی نوع خاصی از کروماتوگرافی تقسیمی است که در آن صفحات کاغذی جای ستون پر شده را می‌گیرند. در این روش فاز ساکن کاغذ است. مولکول‌های سلولز نیز به نوبه خود به وسیله ساختار الیافی کاغذ در وضعیت‌های ثابت نگه داشته می‌شود. در ابتدا کروماتوگرافی کاغذی برای جداسازی مخلوط‌های مواد آلی به کار می رفت. اما امروزه برای جداسازی یون‌‌های معدنی استفاده می‌شود. به وسیله این روش هم آنیون‌ها و هم کاتیون‌ها را می‌توان جداسازی کرد.

 برای انجام این روش قطره‌ای از محلول حاوی مخلوطی که باید جدا شود را روی یک صفحه یا نوار کاغذ صافی در محل علامت گذاری شده قرار می‌دهند. قطره به صورت یک لکه حلقوی در این محل پخش می‌شود. هنگامی که لکه خشک شده کاغذ را در یک ظرف مناسب سربسته طوری قرار می‌دهند که یک سر آن در حلال انتخاب شده به عنوان فاز متحرک فرو رود، حلال از طریق الیاف کاغذ در نتیجه عمل موئینگی نفوذ می‌کند. پس از گذشت زمان از قبل تعیین شده، وقتی حلال مسافت مناسبی را طی کرد، کاغذ را بیرون آورده و حلال را با علامتی مشخص می‌کنند. پس از خشک شدن صفحه وقتی محل های مناطق جدا شده آشکار شدند هر یک از اجسام به طور جداگانه شناسایی می‌شوند. در موارد ایده‌آل ، هر جسم با واکنش گر مکان یاب ، رنگ مخصوصی می‌دهد که در مورد مواد معدنی بیشتر و درمورد مواد آلی کمتر مشاهده می‌شود. ساده‌ترین روش شناسایی بر اساس مقدار Rf یعنی نسبت فاصله طی شده به وسیله جبهه حلال است.

از نقایص کروماتوگرافی کاغذی می‌توان به مواردی چون لکه‌های چند تایی ، دنباله دار شدن  و اثرات لبه یا کناره اشاره کرد. این روش در جداسازی‌ مواد با ماهیت زیستی وسیع ترین کاربرد را داشته و در مسائل کلینیکی و زیست شیمیایی ، جداسازی اسیدهای آمینه و پپتیدها در بررسی ساختارهای پروتئین به کار گرفته می‌شود. آزمایش روزمره ادرار و سایر مایعات بدن برای اسید آمینه و قند، جداسازی بازهای پورین و نوکلئوتیدها در آزمایش اسیدهای نوکلئیک، جداسازی استرئیدها، تجزیه عمومی، تجزیه بسپارها، تشخیص و ارزیابی فلزات در خاک‌ها و نمونه های زمین شناسی، بررسی ترکیبات فنلی در عصاره های گیاهی، جداسازی آلکالوئیدها و جداسازی ترکیبات علامت‌دار به وسیله رادیو ایزوتوپ‌ها از دیگر کاربردهای کروماتوگرافی کاغذی است، البته توجه داشته باشید که برای جداسازی مواد فرار غیر فعال مانند هیدروکربن‌ها و دیگری جداسازی اسیدهای چرب با فراریت بیشتر  این روش مناسب نیست.

 

 نقایص کروماتوگرافی کاغذی

لکه‌های چند تایی :

در کروماتوگرافی یون‌ها فلزی ، اگر دارای آنیونی متفاوت از آنیون موجود در محلول اولیه باشد، ممکن است رقابتی بین آنیون‌ها برای یون فلزی وجود داشته باشد، که در نتیجه دو لکه به دست می‌آید که هر یک از آنها مربوط به یکی از نمکهای فلزی می‌باشد. ممکن است یون فلزی دو کمپلکس متفاوت با حلال ایجاد کند. در جدا سازی‌های آلی ، ممکن است جسم دو شکل متفاوت وجود داشته باشد. به عنوان مثال یک آمینو اسید می‌تواند به صورت کاتیون و یون دو قطبی باشد.

دنباله دار شدن :

اگر مخلوط یه مقدار زیاد از حد روی کاغذ قرار داده شود، یا سرعت عبور حلال متفاوت باشد، جسم نمی‌تواند برای ایجاد یک لکه مجزا به تعادل برسد. در این صورت این لکه ، در سطح بزرگی از کاغذ پخش شده و از حلال در حال پیشروی عقب می‌ماند. دنباله‌دار شدن ممکن است به سبب اثرات جذبی سطحی تر ایجاد شود.

اثرات لبه یا کناره :

لکه‌ها خیلی نزدیک به کنار نوار ، ممکن است در امتداد کنار کاغذ پخش شوند، عمل نفوذ ممکن است به علت بالا بودن غلظت موضعی فاز متحرک در آن ناحیه ، و یا به علت بالاتر بودن سرعت تبخیر حلال در کنار کاغذ ، که منجر به اثرات تقسیمی غیرعادی می‌شوند، باشد.

روش کمی کروماتوگرافی کاغذی 

کاربرد کمی این روش نه تنها احتیاج به یک جداسازی کمی ، بلکه مکان‌یابی و ارزیابی کمی اجسام موجود نیز دارد. یک جداسازی کیفی رضایت بخش ، الزاما برای کار کمی مفید نیست. اندازه گیری کمی را می‌توان یا با سنجش مقدار جسم موجود در لکه روی کاغذ ، یا با خارج کردن جسم از کاغذ و تجزیه اجزای جدا شده به وسیله روش‌های کمی متداول انجام داد. لکه اولیه از نمونه مناسب روی کاغذ قرار می‌دهند، خشک کردن لکه باید تحت شرایط استاندارد زمان و دما صورت گیرد.
در تهیه حلال باید دقت زیادی روی نسبت‌های اجزای صورت گیرد، برقرار ساختن تعادل باید به طور استاندارد انجام گیرد، طول عبور حلال در تمامی نوبت‌ها یکسان باشد، در طول آزمایش ، دما باید ثابت بماند، و خشک کردن ورقه باید در یک زمان و دمای استاندارد انجام گیرد. واکنشگر مکان‌یاب (در صورت استفاده از لکه‌های رنگی) باید به طریق کاملا تکرارپذیر افزوده شود. و هر عمل بعدی ، مانند خشک کردن یا قراردادن در معرض بخار آمونیاک ، باید در مدت استاندارد انجام گیرد. مقدار جسمی که در یک جداسازی کروماتوگرافی باید روی کاغذ قرار گیرد، متغیر است.

موارد استعمال کروماتوگرافی کاغذی 

منابع علمی مربوط به روش‌های تجزیه‌ای و بررسی ترکیبات طبیعی نشان می‌دهد که کروماتوگرافی کاغذی در هر رشته‌ای کاربرد دارد. با این همه ، این روش هنوز هم در جداسازی‌های مواد با ماهیت زیستی وسیعترین کاربرد را دارد.
کروماتوگرافی کاغذی اکثرا به عنوان یک وسیله تحقیقاتی به کار می‌رود، و به طور گسترده‌ای در تجزیه‌های روزمره مخصوصا در جداسازی‌های جدیدی که هیچ روش کلاسیک برای آنها وجود ندارد، نیز مورد استفاده قرار می گیرد. روش اخیر در مسائل کلینیکی و زیست شیمیایی ، جداسازی اسیدهای آمینه و پپتیدها در بررسی ساختارهای پروتئین کاربد دارد.
آزمایش روزمره ادرار و سایر مایعات بدن برای اسید آمینه و قند ، جداسازی بازهای پورین و نوکلئوتیدها در آزمایش اسیدهای نوکلئیک ، جداسازی استرئیدها ، تجزیه عمومی ، تجزیه بسپارها ، تشخیص و ارزیابی فلزات در خاک ها و نمونه های زمین شناسی ، بررسی ترکیبات فنلی در عصاره های گیاهی ، جداسازی آلکالوئیدها ، جداسازی ترکیبات علامت دار به وسیله رادیو ایزوتوپ‌ها ، کروماتوگرافی کاغذی برای جداسازی مواد فرار غیر فعال مانند هیدروکربن‌ها و دیگری جداسازی اسیدهای چرب با فراریت بیشتر مناسب نمی باشد.

 

 

کروماتوگرافی تقسیمی

 

کروماتوگرافی تقسیمی نمونه‌ای از کروماتوگرافی مایع-مایع است که فاز جامد یک لایه از محلول ( مثل آب ) است که روی سطح یک جامد ناصاف مثل سیلیکاژل و یا خاک سیلیسی قرار دارد و فاز متحرک مایعی است که غیر محلول در مایع اولی می‌باشد.

 

اطلاعات اولیه

در جداسازی مواد بوسیله کروماتوگرافی تقسیمی در ستون ، شیوه کار بسیار شبیه به شیوه کروماتوگرافی جذب سطحی است. اختلاف اصلی دو روش در ماهیتماده پر شده در ستون است. 

اساس کار کروماتوگرافی تقسیمی

سرعت حرکت یک جزء از مخلوط تابع انحلال پذیری آن در فاز ساکن است. به عبارت دیگر ، جدا شدن اجزا بر اساس تقسیم بین دو مایع است. اجسامی که بیشتر حل می‌شوند، کندتر از اجسامی که کمتر حل می‌شوند به طرف پایین ستون حرکت می‌کنند. در جریان عبور از ستون ، اجسام میان دو فاز تقسیم می‌شوند و جداسازی مواد بر اساس اختلاف میان ضرایب تقسیم آنها انجام می‌شوند. 

 

یک مورد خاص

کروماتوگرافی کاغذی مورد خاصی از کروماتوگرافی تقسیمی به شمار می‌رود که در آن صفحات کاغذی جای ستون پر شده را می‌گیرند. 

خصوصیات

یکی از خصوصیات اساسی کروماتوگرافی این است که مخلوط اجسام ابتدا به صورت یک نوار در ستون که در نتیجه جذب سطحی یا جذب به وسیله فاز ساکن به وجود می‌آید، ظاهر می‌شود. برای جداسازی مواد اجزای باید عمل دیگر روی نوار انجام گیرد. تجزیه به روش‌های گوناگونی انجام می‌گیرد. 

مقایسه با کروماتوگرافی جذب سطحی

می‌توان گفت که روش‌های تقسیمی برای جداسازی ترکیبات شیمیایی نزدیک به هم ، مانند اعضای سری‌های ترکیبات مشابه ، مناسب‌تر است. مزیت اصلی روش تقسیمی این است که نوارهای کروماتوگرافی حاصل ، به علت وجود دنباله ، نسبتا باریک و در نتیجه استفاده از ستون‌ها کارآمدتر است. ظرفیت یک ستون تقسیمی ، در واحد حجم ، غالبا کوچک‌تر از ظرفیت یک ستون جذب سطحی بوده و گاهی این اختلاف خیلی زیاد است. 

 

کروماتوگرافی جذب سطحی (Adsorption Chromatography)

 

کروماتوگرافی جذب سطحی (Adsorption Chromatography) ، نمونه‌ای از کروماتوگرافی مایع – جامد است که در آن عمل جداسازی مواد بعلت متفاوت بودن جذب سطحی اجزای مختلف مخلوط و فاز ساکن (جامد) انجام می‌گیرد.

 

ستون کروماتوگرافی جذب سطحی

برای جداسازی مواد یک مخلوط ‏‏‏‎، می‌توان از ستون استفاده کرد. داخل این ستون با جامد فعالی مانند آلومین (فاز ساکن) پر شده است و با حلالی مانند هگزان(فاز متحرک) پوشیده شده است. هرگاه نمونه کوچکی از مخلوط در بالای ستون قرار گیرد ، نواری از ماده جذب شده تشکیل می‌شود، حلال با عبور خود از میان ستون اجزای مخلوط را با خود حمل می‌کند. 

جداسازی کامل

سرعت حرکت هر جزء‏ ، به میزان جذب سطحی آن بر روی ماده داخل ستون بستگی دارد. به این ترتیب ، ماده‌ای که کم جذب شده است، سریع‌تر از ماده‌ای که زیاد جذب شده است، حرکت می‌کند. واضح است که اگر اختلاف بین جذب‌های سطحی به حد کافی زیاد باشد، جداسازی مواد کامل انجام خواهد گرفت. اجزایی که قابلیت جذب بالاتری دارند، در قسمت بالای ستون و اجسامی که کمتر جذب می‌شوند در قسمت‌های پایین ستون ، جذب خواهند شد. 

 

نیروهای بین اجزا

این نیروها ممکن است یا از نوع نیروهای واندروالسی ، مانند نیروهایی که در مورد آلومین است یا از نوع نیروهای الکترستاتیک باشند، مانند جداسازی یون‌هابوسیله کروماتوگرافی تبادل یونی که در آن فاز ساکن یک ماده مبادله کننده یون است ، یا ممکن است از یک ستون که از ماده مناسب متخلخلی پر شده، برای جدا کردن مواد حل‌شده بر اساس اندازه مولکول آنها استفاده کرد، مانند کروماتوگرافی ژلی.

کروماتوگرافی لایه نازک نمونه ویژه‌ای از کروماتوگرافی جذب سطحی است که در این روش ، به جای اینکه جاذب را در یک ستون استوانه‌ای پر کنیم، آن را بصورت لایه نازک روی یک صفحه شیشه‌ای یا لایه پلاستیکی یا ورقه فلزی قرار می‌دهیم. 

 

مقایسه با کروماتوگرافی تقسیمی

روش‌های جذب سطحی ، برای جداسازی مواد انواع مختلف ترکیبات شیمیایی بهتر هستند. ظرفیت یک ستون جذب سطحی ، در واحد حجم ، غالبا بزرگتر از ظرفیت یک ستون تقسیمی بوده و گاهی این اختلاف خیلی زیاد است. 

 

 مزیت روش‌های سوانگاری (کروماتوگرافی )

 

با روشهای کروماتوگرافی می‌توان جداسازی‌هایی را که به روش‌های دیگر خیلی مشکل می‌باشند انجام داد. زیرا اختلافات جزئی موجود در رفتار جزئی اجسام در جریان عبور آنها از یک سامانه کروماتوگرافی چندین برابر می‌شود. هر قدر این اختلاف بیشتر شود قدرت جداسازی مواد بیشتر و برای انجام جداسازی مواد نیاز کمتری به وجود اختلافات دیگر خواهد بود.

مزیت کروماتوگرافی نسبت به ستون تقطیر این است که نسبتاً آسان می‌توان به آن دست یافت با وجود اینکه ممکن است چندین روز طول بکشد تا یک ستون تقطیر به حداکثر بازده خود برسد ولی یک جداسازی مواد کروماتوگرافی می‌تواند در عرض چند دقیقه یا چند ساعت انجام گیرد.

یکی از مزایای برجسته روش‌های کروماتوگرافی این است که آنها ملایم هستند. به این معنی که احتمال تجزیه مواد جداشونده به وسیله این روش‌ها در مقایسه با سایر روش‌ها کمتر است.

مزیت دیگر روش‌های کروماتوگرافی در این است که تنها مقدار بسیار کمی از مخلوط برای تجزیه لازم است به این دلیل روش‌های تجزیه‌ای مربوط به جداسازی مواد کروماتوگرافی می‌توانند در مقیاس میکرو و نیمه میکرو انجام گیرند.

روش‌های کروماتوگرافی ساده سریع و وسایل مورد لزوم آنها ارزان هستند. مخلوط‌های پیچیده را می‌توان نسبتاً به آسانی به وسیله این روش‌ها به دست آورد.

مواد نوع کروماتوگرافی مواد شیمیایی مشابه کروماتوگرافی تقسیمی مواد شیمیایی غیر مشابه کروماتوگرافی جذب سطحی گازها و اجسام فرار کروماتوگرافی گازی مواد یونی و معدنی

کروماتوگرافی تبادل یونی در ستون کروماتوگرافی کاغذی یا لایه نازک الکترفورز ناحیه‌ای مواد یونی و غیر یونی کروماتوگرافی تبادل یون یا ژلی مواد زیستی و ترکیباتی با جرم مولکولی نسبی بالا کروماتوگرافی ژلی الکتروفورز

 

کروماتوگرافی ژلی 

در مطالعات جذب سطحی بر روی سیلیکاژل و کربن فعال ، اثرات الک مولکولی با موادی که جرم مولکولی بالایی دارند، مشاهده شده است. جداسازی‌های مبتنی بر الک کردن مولکولی را می‌توان بر روی اجسام بی‌بار در جریان مهاجرت الکترو اسمزی از داخل ژل‌ها انجام داد. این اساس جداسازی‌هایی را که مبتنی بر اندازه‌های نسبی مولکول‌ها هستند، تشکیل می‌دهند و از اصطلاح صاف کردن بوسیله ژل استفاده می‌شود.

سیر تحولی و رشد 

در سال ۱۹۵۴ ، “مولد وسینچ” نشان دادند که جداسازی‌ها مبتنی بر الک کردن مولکولی را می‌توان بر روی اجسام بی‌بار از داخل ژل‌ها انجام داد. در سال ۱۹۵۹ “پورات” و “فلودین” ، اصل معینی را ارائه دادند و از اصطلاح ، صاف کردن بوسیله ژل برای شرح روش خودشان در مورد جداسازی مواد مولکول‌هایی با منشاء زیستی در سیستم‌های آبی بوسیله ژل‌های پلی‌ساکارید استفاده کردند.
ولی “دترمان” در سال ۱۹۶۴ پیشنهاد کرد که کروماتوگرافی ژلی ( Gel Cromatography ) ، عمومی‌ترین اسم برای این شیوه است.

نکات قابل توجه این روش 

در کروماتوگرافی ژلی ، فاز ساکن از یک قالب بسپار متخلخل تشکیل شده است که منفذهای آن بوسیله حلالی که به عنوان فاز متحرک بکار می‌رود، کاملا پر شده است. اندازه سوراخ بسیار مهم است چون اساس جدایی بر این است که مولکولی‌های بزرگتر از یک اندازه معین اصلا وارد سوراخ‌ها نشوند و تمام یا قسمتی از سوراخ‌ها برای ورود مولکول‌های کوچکتر آماده است. جریان فاز متحرک موجب می‌شود که مولکول‌های بزرگتر بدون برخورد با مانعی ، بدون نفوذ در قالب ژل از ستون عبور کنند، در حالی‌که مولکول‌های کوچک‌تر بر حسب شدت نفوذ آنها در ژل در ستون نگه داشته می‌شوند.

خروج اجزای مخلوط 

بدین ترتیب اجزای مخلوط به ترتیب جرم مولکولی نسبی از ستون خارج می‌شوند، ابتدا بزرگترین مولکول خارج می‌شود. ترکیباتی که اصلا وارد ژل نمی‌شوند از یکدیگر جدا نمی‌شوند و همچنین مولکول‌های کوچکی که کاملا در ژل نفوذ می‌کنند، از یکدیگر جدا نمی‌شوند. مولکول‌های کوچکی که کاملا در ژل نفوذ می‌کنند از یکدیگر جدا نمی‌شوند. مولکول‌های با اندازه متوسط بر حسب درجه نفوذ آنها در قالب در ستون نگه داشته می‌شوند. اگر مواد ترکیب شیمیایی مشابه داشته باشند، به ترتیب جرم مولکولی نسبی از ستون شسته می‌شوند.
مقایسه با کروماتوگرافی تقسیمی 
از اثرات جذب سطحی بر روی سطح ذرات ژل معمولا می‌توان صرف نظر کرد و در نتیجه کروماتوگرافی ژلی را می‌توان به‌عنوان نوعی کروماتوگرافی تقسیمی در نظر گرفت. مایع موجود در داخل قالب ژل ، فاز ساکن و شوینده سیالی که بقیه ستون را پر می‌کند، فاز متحرک را تشکیل می‌دهند. به‌عبارت دیگر ، یک ستون تقسیمی داریم که در آن دو فاز مایع ، متحرک و ساکن ، ترکیب یکسانی دارند.

ماهیت ژل کروماتوگرافی 

ژل باید تا حد ممکن از نظر شیمیایی بی‌اثر و از نظر مکانیکی تا حد امکان پایدار باشد. مواد ژلی بصورت دانه تهیه می‌شوند و لازم است همانند رزین‌های تبادل یونی ، اندازه ذرات نسبتا یکنواخت باشد و تخلخل یکنواختی داشته باشد.

نمونه 

گرانروی نمونه مهم است و نباید از دو برابر گرانروی شوینده بیشتر باشد. حجم نمونه نیز مهم است. هر قدر حجم نمونه کمتر باشد، کاهش غلظت هر جزء در محلول خارج شده بیشتر خواهد بود. این اثر رقیق شدن در تصمیم‌گیری در مورد اندازه‌های ستون و نمونه باید مد نظر قرار گیرد.

کاربرد کروماتوگرافی ژلی 

با اینکه این روش بیشتر برای جداسازی‌هایی در مقیاس کوچک در کارهای تحقیقاتی و تجزیه‌های روزمره بکار می‌رود، ولی کاربردهایی نیز در مقیاس بالاتر در تولیدات صنعتی دارد. کروماتوگرافی ژلی ابتدا برای جداسازی مواد مولکول‌های بزرگی که منشاء زیستی دارند، مانند پروتئین‌ها ، پلی‌ساکاریدها ، اسیدهای نوکلئیک و آنریم‌ها بکار رفت و هنوز هم بیشترین کاربرد این روش در همین زمینه‌ها است.
اخیرا جداسازی مواد و بررسی بسپارهای مصنوعی ، حدود کاربرد این روش را افزایش داده‌اند و این روش ، قسمت مهمی از تکنولوژی بسپارها شده است. نمک‌زدایی از محلول‌ها برای مثال از پروتئین‌ها، یکی از کاربردها‌ی مهم محیط‌های ژلی است.

 

انتخاب بهترین روش کروماتوگرافی

 

انتخاب نوع روش کروماتوگرافی بجز در موارد واضح (مانند کروماتوگرافی گازی در جداسازی مواد گازها) عموماً تجربی است. زیرا هنوز هیچ راهی جهت پیش بینی بهترین روش برای جداسازی مواد اجسام مگر در چند مورد ساده وجود ندارد. در ابتدا روش‌های ساده‌تر مانند کروماتوگرافی کاغذی و لایه نازک امتحان می‌شوند. زیرا این روش‌ها در صورتی که مستقیماً قادر به جداسازی مواد نباشند نوع سیستم کروماتوگرافی را که جداسازی مواد بوسیله آن باید صورت بگیرد، مشخص می‌کنند آنگاه در صورت لزوم از روش‌های پیچیده‌تر استفاده می‌شود. از فهرست زیر می‌توان به عنوان یک راهنمای تقریبی استفاده کرد:

• مواد----نوع کروماتوگرافی
• مواد شیمیایی مشابه---- کروماتوگرافی تقسیمی
• مواد شیمیایی غیر مشابه-کروماتوگرافی جذب سطحی
• گازها و اجسام فرار----کروماتوگرافی گازی
• مواد یونی و معدنی ----کروماتوگرافی کاغذی یا لایه نازک – کروماتوگرافی تبادل یونی درستون
• مواد یونی و غیر یونی ---کروماتوگرافی تبادل یون یا ژلی
• مواد زیستی ---- کروماتوگرافی ژلی الکتروفورز

در جداسازی‌های مشکل وقتی که روش‌های ساده فاقد کارایی لازم هستند روش کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا (HPLC) می‌تواند جوابگو باشد.

 

فیلم آموزشی نحوه بستن ستون کروماتوگرافی (زبان فیلم انگلیسی است)