تولید پروتئین نوترکیب مزایا و چالش ها - صفحه ششم

امتیاز کاربران

ستاره فعالستاره فعالستاره فعالستاره فعالستاره فعال
 

2-1-1- عدم بیان پروتئین و یا بیان به میزان کم

این وضعیت ممکن است به عنوان بدترین سناریو ممکن در نظر گرفته شود. در این حالت پروتئین مورد نظر نمی تواند از طریق تکنیک های حساس مانند وسترن بلات شناسایی شود و یا اینکه شناسایی می شود ولی در سطح بسیار پایین(کمتر از میلی گرم در یک لیتر از کشت). اغلب مشکل مربوط می شود به تاثیر مضری که پروتئین هترولوگوس بر روی سلول میزبان دارد[10]. عدم بیان پروتئین می تواند ناشی از دو عامل باشد :1-سمیت پروتئین 2-ارجحیت کدونی[10]

2-1-1-1-سمیت پروتئین

مشکل سمیت پروتئین ممکن است زمانی ایجاد شود که پروتئین نوترکیب یک عملکرد غیر ضروری یا کشنده بر روی سلول میزبان دارد. این عملکرد با تقسیم سلولی نرمال و هموستازی میکروارگانیسم تداخل پیدا می کند و نتیجه ی آشکار آن سرعت رشد و چگالی سلولی کمتر و مرگ می باشد. سمیت پروتئین می تواند ناشی از دو عامل باشد: سمیت ژنی و بیان پایه ی mRNA/پروتئین سمی ، که سمیت ژنی در اینجا مورد بحث قرار نمی گیرد. به منظور کنترل بیان پایه ی mRNA/پروتئین سمی  کنترل سنتز پایه توسط پروموترها یکی از گزینه های پیش رو است. فراهم کردن محیط تعریف شده با استفاده از گلوکز به عنوان منبع کربن نیز می تواند انتخاب مناسبی باشد. راه حل دیگر می تواند حذف پروتئین از سلول باشد.گاهی اوقات ترشح به پری پلاسم یا محیط تنها راه برای تولید یک پروتئین نوترکیب است[10].

2-1-1-2- ارجحیت کدونی

بیان پروتئین های هترولوگ در E.coli و سایرمیکروارگانیسم ها به طور قوی تحت تاثیر ارجحیت کدونی قرار دارد . این پدیده زمانی اتفاق می افتد که کدون استفاده شده مربوط به mRNA کد کننده پروتئین خارجی ، با باکتری متفاوت باشد . این گونه تصور می شد که ریبوزوم در مواجه با یک  کدون نادر مکث می کند و ممکن است از mRNA جدا شود بنابراین بازده بیان پروتئین کاهش می یابد [12]. بعلاوه گفته شده است که برای بهبود بیان پروتئین ها باید کدون های نادر را از طریق جایگزینی آنها با کدون های رایج حذف کرد. بنابراین جایگزینی کدون های نادر با کدون های رایج یک روش کاربردی مرسوم در بیان ژن های هترولوگوس به منظور افزایش بازده پروتئین است. از سوی دیگر مشاهده شد که  در برخی از موارد این جانشینی منجر به کاهش حلالیت و پایداری پروتئین می شود. در واقع طراحی ژن می تواند منجر به تا خوردن غیر طبیعی پروتئین و درنتیجه کاهش در حلالیت و فعالیت پروتئین گردد[13]. به نظر می رسد کدون های AGG/AGA ،AUA،CUA،CGA  (به احتمال زیاد CGG) و CCC از نقطه نظر ترجمه در E.coli مشکل ایجاد کنند. مطالعات نشان می دهد برای حل این مشکل می توان از پلاسمید حاوی ژن های tRNA مناسب استفاده کرد و یا با سنتز ژن، این کدون ها را از ژن حذف کرد. استفاده از محیط بیانی مناسب هم تاثیر گزار است[14]. به عنوان مثال DNA مواد حساسیت زای بادام زمینی حاوی میزان زیادی از کدون هایی است که در E.coli به میزان کمی استفاده می شوند ،یعنی AGG/AGA . برای افزایش بیان این پروتئین ها در E.coli سویه BL21(DE3) تغییر یافته و سویه BL21-CodonPlus(DE3)-RIL ایجاد گردید که در آن یک کپی اضافی از ژن های tRNA های argU، ileY و leuW وجود داشت. در نهایت بازده کلی به میزان 100 برابر بیشتر از آنچه بود که به وسیله سویه BL21 به دست می آمد[15] . در مطالعه ی دیگری ژن های پارازیت ها را مورد بررسی قرار دادند. ژن های پارازیت ها اغلب حاوی کدون هایی هستند که به ندرت در ژن های با بیان بالای E.coli حضور دارند. برای بیان ژن های پلاسمودیوم با غلبه بر ارجحیت کدونی ،یک روش مهندسی کردن ژن های پلاسمودیوم است به گونه ای که دارای کدون هایی باشد که در E.coli ترجیح داده می شوند اما این روش هزینه بر و وقت گیر است. بنابراین در این مطالعه از انتقال یک پلاسمید که حاوی ژن های مربوط به tRNA کدون های نادر بود استفاده شد و سطح بیان افزایش یافت. در این روش از پلاسمید RIG استفاده شد که حاوی ژن های سه tRNA ،آرژنین، ایزولوسین و گلایسین بود. استفاده از این پلاسمید سطح بیان پروتئین را به میزان زیادی بالا برد[16].

2-1-2- شکل گیری اینکلوژن بادی

تولید پروتئین های عملکردی  در E.coli نیازمند یک تعادل ظرفیت بین رونویسی DNA ، ترجمه پروتئین و تا شدن پروتئین است. بیان بالای پروتئین نوترکیب در E.coli می تواند تا 30 درصد از کل پروتئین تولید شده در سلول میزبان را به خود اختصاص دهد در حالیکه چاپرون ها و مدولیتور ها به شدت دوز مشخصی دارند. علاوه بر این تا شدن صحیح بسیاری از پروتئین ها نیازمند شکل گیری باندهای دی سولفیدی یا گلیگوزیلاسیون است که در E.coli تشکیل نمی شوند. بنابراین بیان بسیاری از پروتئین ها در E.coli مقدار زیادی از پروتئین های تا نشده [11]یا اشتباه تا شده[12] را در سیتوپلاسم ایجاد می کند،جاییکه این پروتئین ها تمایل دارند تجمع یابند و اینکلوژن بادی ها را ایجاد کنند[17] .اینکلوژن بادی ها به صورت غیر فعال و غیر محلول هستند و در بعضی شرایط یک مانع قابل توجه در به دست آوردن پروتئین فعال هستند. با این وجود در برخی از موارد اینکلوژن بادی ها مفید می باشند چرا که تولید با بازده بالا صورت می گیرد، نسبت به پروتئولیز مقاومند، تغلیظ آنها با سانتریفوژ آسان تر است و حداقل آلودگی را با سایر پروتئین ها دارند[6]. بسیاری از داروهای تجاری و توسعه یافته مانند اینترفرون ها و اینترلوکین ها به صورت اینکلوژن بادی تولید می شوند.[17]

یک روش معمول برای پیشبرد بیان پروتئین ها به فرم محلول و جلوگیری از شکل گیری اینکلوژن بادی ها قرار دادن یک تگ در انتهای N- ترمینال  و یا C- ترمینال پروتئین است که به افزایش حلالیت پروتئین منجر می شود. فیوژن پارتنرهایی که حلالیت پروتئین های نوترکیب را افزایش می دهند عبارتند از :

Glutathione-S-transferase (GST)

Ubiquitin-modifier (SUMO)

Thioredoxin

Maltose-binding protein (MBP)

N-utilization substrate (NusA)

MPB و  GST دارای یک برتری دیگری هم هستند به طوریکه می توان از این ها به عنوان تگ تمایلی هم در خالص سازی استفاده کرد. SUMO ، thioredoxin و NusA برای خالص سازی نیازمند تگ تمایلی هستند که معمولا از His-tag استفاده می شود[1, 5].thioredoxin  به دلیل سایز کوچکی که دارد (11.8 kDa) این امکان را فراهم می کند که پروتئین هدف درصد بیشتری از فیوژن را به خود اختصاص دهد. فیوژن GST در بسیاری از موارد به شدت مستعد شکست پروتئولیتیک است و سبب ایجاد پروتئین های ناکارآمد می شود.SUMO قادر است تا شدن را بهبود بخشد و همچنین حلالیت پروتئین مورد نظر را افزایش دهد این تگ هم مانند thioredoxin سایز کوچکی دارد و قادر است نسبت تقریبا بالای پروتئین به پپتید را فراهم کند که تاثیر مثبتی روی بازده پروتئین دارد [1].

به طور طبیعی هنگامی که پروتئین نوترکیب در سیتوپلاسم E.coli بیان می شود تشکیل باندهای دی سولفیدی ناکارآمد است . تولید پروتئین های دارای باند دی سولفیدی یک چالش عمده در بحث تولید در مقیاس بالا است. شکل گیری باندهای دی سولفیدی نرمال تنها در پری پلاسم اتفاق می افتد که به وسیله ی سیستم Dsb کاتالیز می شود[5]. در بخش هایی که باند دی سولفیدی به طور طبیعی اتفاق می افتد دو مرحله ی مجزا در بیوسنتز وجود  دارد:1- کاتالیز  از نو[13] باندهای دی سولفیدی 2- ایزومریزاسیون باندهای ایجاد شده برای رسیدن به باندهای دی سولفیدی نرمال [18]. استراتژی هایی که برای پیشبرد باند های دی سولفیدی در E.coli به کار می رود در دو دسته قرار می گیرند .دسته اول هدایت پلی پپتید در حال تولید به سمت محیط خارجی و دسته دوم تغییر اکسیداسیون سیتوپلاسم تا رسیدن به یک محیط اکسیداتیو مناسب. هدایت پلی پپتید ترجمه شده به فضای پری پلاسمی دلایل فیزیولوژیکال واضحی دارد: 1- پری پلاسم بر عکس سیتوپلاسم حالت اکسید دارد 2- پری پلاسم محل آنزیم های کاتالیز کننده شکل گیری و ایزومریزاسیون باندهای دی سولفیدی است. بعلاوه چاپرون ها و فولدازها ها نیز در این ناحیه قرار دارند. مشاهده شده بیان همزمان [14]پروتئین های خانواده Dsb برای تا خوردن صحیح پروتئین های دارای باند دی سولفیدی کارآمد است[19] . Thioredoxin reductase  و Glutathion reductase آنزیم هایی هستند متعلق به سیستم Dsb  که سبب می شوند در سیتوپلاسم تیردوکسین و گلوتاردوکسین قادر  باشند سیستئسن ها را احیا کنند. اختلال در ژن های trxB و gor می تواند سبب شود در سیتوپلاسم باندهای دی سولفیدی ایجاد گردد[20]. در یک بررسی نشان داده شد که با استفاده از کاتالیزورهایی برای شکل گیری باندهای دی سولفیدی و کاتالیزورهایی برای ایزومریزاسیون باندهای دی سولفیدی می توان مقدار بالایی از پروتئین های دارای باند دی سولفیدی را در سیتوپلاسم E.coli تولید کرد. در این روش از Erv1p که یک سولفهیدریل اکسیداز  است به همراه یک دی سولفید ایزومراز استفاده شد.لازم به ذکر است که در این روش نیاز به بر هم زدن مسیرهای احیایی نبود. سویه های ∆gor∆trxB و همچنین سیستم هایی که بیان Dsbc در سیتوپلاسم آنها صورت می گیرد اگرچه پروتئین های دارای باند دی سولفیدی تولید می کنند ولی بازده آنها بسیار پایین است چرا که مسیر از نو ایجاد باندهای دی سولفیدی را ندارند.سولفهیدریل اکسیداز یک کاتالیست طبیعی شکل گیری از نو باندهای دی سولفیدی در E.coli است و امکان تولید پروتئین های دارای باند دی سولفیدی را بدون اختلال در مسیرهای احیایی فراهم می سازد. با استفاده از این روش و اجرای متدهایی مانند حفظ حدواسط های تا خورده به صورت محلول و استفاده از محیط کشت جایگزین سطح بیان پروتئین vtPA که دارای 9 باند دی سولفیدی است به میزان 800 برابر افزایش یافت[18].

چاپرون های مولکولی پروتئین هایی هستند که به تا خوردن پروتئین ها کمک می کنند. برای جلوگیری از شکل گیری اینکلوژن بادی ها استراتژی بیان همزمان مولکول های چاپرونی در بسیاری از موارد دنبال شده است. در واقع ثابت شده است که بیان همزمان ژن های کد کننده چاپرون ها و پروتئین های هدف در به دست آوردن فرم محلول پروتئین تاثیر گزارند[9]. برای بیان بیشترفرم فعال D-ANase، D-AGase و D-AAase در E.coli، از بیان همزمان چاپرون های مختلف استفاده شد و در نهایت مشاهده گردید که بیان همزمان چاپرون های GroELS و TF با  D-ANase و D-AGase به ترتیب میزان بیانشان را 1.3 برابر و 1.8 برابر افزایش یافته و پروتئین ها را به فرم فعال  تولید می کنند. بیان همزمان D-AAase با ژن TF منجر به افزایش 4.3 برابری در فعالیت آن گردید[21]. اندوستاتین [15]پروتئینی است که به فرم اینکلوژن بادی در E.coli تولید می شود. بیان این پروتئین به همراه بیان همزمان چاپرون های Dnak-DnaJ-GrpE و GroEL/ES به همراه تخمیر در دمای پایین(16 درجه سانتی گراد) به میزان زیادی در جلوگیری از  لخته شدن اندوستاتین هنگام بالا بردن میزان بیان موثر بود[22]. در بررسی دیگر Neuronal nitric oxid synthase(nNOS) با کمک چاپرون ها به فرم فعال و بازده بالا در E.coli بیان گردید. به کمک این روش موفق به تولید 20-24mg از nNOS در هر لیتر از سلول شدند حال آنکه میزان تولید nNOS در 20 لیتر از کشت سلول های human kidney 293  تنها 8-10mg بود. از طرف دیگر تولید nNOS با سیستم baculovirus هم منجر به تولید فرم غیر فعال nNOS شد چرا که این سیتم قادر نیست مولکول هِم  را به درستی در ساختار nNOS قرار دهد. بنابراین این روش هر دو مشکل بازده پایین و غیر فعال بودن محصول را برطرف کرد.علت موفقیت این روش را می توان به 3 عامل نسبت داد:1-استفاده از وکتور pWC که در پیشبرد قرار گیری مناسب هِم در ساختار nNOS نقش دارد و در نتیجه پروتئین را به فرم فعال تولید می کند2- بیان همزمان چاپرون های GroEL و GroES 3- استفاده از سویه BL21 که پروتئاز های آن غیرفعال گردیده بود. در نبود چاپرون ها بیان Nnos در سویه BL21 غیر قابل تشخیص بود[23]. در مطالعه دیگر از یک روش دو مرحله ای برای افزایش بیان پروتئین ها به فرم محلول استفاده شد.در مرحله اول چهار سیستم چاپرونی GroEL/GroES ، DnaK/DnaJ/GrpE ، ClpB و HSP های کوچک bpA/IbpB به صورت هماهنگ با پروتئین های نوترکیب co-overproduce  شدند. در مرحله دوم بیوسنتز پروتئین مهار شد تا به چاپرون ها اجازه داده شود که تا شدن دوباره پروتئین هایی که به درستی تا  نشده اند و تشکیل لخته های پروتئین  داده اند را انجام دهند. .این روش حلالیت 70 درصد از پروتئین هایی را که بررسی شده بودند را به میزان 42 برابر افزایش داد[24].

یکی از ساده ترین روش ها برای به حداقل رساندن شکل گیری اینکلوژن بادی ها کاهش دما است. عموما بیان در دمای پایین منجر به افزایش حلالیت و تا خوردن صحیح می شود. این امر ناشی از این مساله  است که اینترکشن های هیدروفوبیک که تعیین کننده اینکلوژن بادی ها هستند وابسته به دما می باشند. از سویی احتمالا کاهش دما سرعت رونویسی، ترجمه و باز تا شدن[16] را پایین می آورد و بنابراین اجازه شکل گیری تا خوردن صحیح را می دهد. جدای از این هر نوع بیانی که در رابطه با فنوتیپ سمی است و در دمای 37 درجه دیده می شود ، در دماهای پایین سرکوب می گردد. همچنین در دمای پایین افزایش بیان و فعالیت شماری از چاپرون ها در E.coli گزارش شده است. مشاهده شده که پروتئازهای شوک حرارتی که طی افزایش بیان  القا می شوند در شرایط دمایی پایین فعالیت کمتری دارند و بنابراین رشد در رنج دمایی 15-23 درجه سانتی گراد منجر به کاهش قابل توجهی در تخریب پروتئین نوترکیب می شود[5, 25]. در یک بررسی مشخص شد که القای Human phosphodioesterase(PDE-3A,PDE-5A) و P38-α map kinase به ترتیب در 22 درجه و 18 درجه منجر به افزایش تولید این آنزیم ها به فرم فعال می شود.اگرچه واضح است که رشد در درجه حرارت پایین معایبی خواهد داشت که می تواند شامل کاهش رونویسی و ترجمه و در نتیجه سرعت پایین تغییر و تبدیل پروتئین های نوترکیب گردد[9]. در بررسی دیگری از ویژگی ژن cspA برای بهبود یکسری از وکتورهای بیانی که pCOLD  نامیده می شوند استفاده شد.این وکتور پس از القا به وسیله ی شوک سرمایی بیان بالای ژن های کلون شده را تحریک می کند[25].

ساعت کاری

بیو وان در تمامی زمینههای آموزشی و پژوهشی با تخصصیترین گروه آماده ارائه خدمات میباشد

  • شنبه تا چهارشنبه : 8.00 صبح - 8.00 عصر
  • پنجشنب : 7.30 صبح - 9.30 عصر
  • جمعه : 7.00 صبح - 10.00 عصر

تماس با ما

آدرس : تهران- میدان انقلاب، خیابان کارگر شمالی،کوی دانشگاه تهران

  • ایمیل :gholamitilko@gmail.com
  • ساعت کاری : 7.30 صبح - 9.30 شب
  • شماره تماس : 09108350291
  • facebook
  • twitter
  • google
  • instagram
تمام حقوق این سایت متعلق به گروه bio1 به سرپرستی پوریا غلامی تیلکو می باشد . نقل مطالب متمم به هر شیوه و با هر عنوان، تخلف محسوب شده و متخلفین بر اساس قوانین جاری کشور مورد پیگرد قانونی قرار می گیرند.